Western Blot专用自发光Marker0.5mL(1

Western 实验步骤

液裂解细胞，用移液器适当吹打使细胞脱落，大瓶贴壁细胞可以先用胰酶洗脱下来后再裂解，裂解方法仿照悬浮细胞处理。 B、 悬浮细胞的处理：先将悬浮细胞置于 EP 管中 3000 rpm 离心 5 min 去掉上清培养基，每 20 μL 体系细胞加 100 μL 裂解液反复吹打至细胞完全破碎。 处理好的样品 12000 rpm 离心 5 min，取上清即为提取的蛋白。置于 4 ℃ 可保存一周，-20℃ 可保存约 2 个月，-80 ℃ 可保存半年。 蛋白浓度的测定：酶标板，酶标仪、离心机、1 mg/mL

操作篇：western blot 之发光鉴定

Marker，进行分析与扫描。 2．AP-NBT/BICP 显色法： 每片 NBT/BICP 可溶解于 30 ml 水中，使用前将一片分装在 30 个 EP 管中，每张 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。将 PBST 或 TTBS 洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 NBT/BICP 溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色 20 s 后每 10 s 观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

操作篇：western blot 之封闭及杂交

封闭及杂交 在做杂交时，个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，这样节约抗体。 操作开始： 1. 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白 marker 则可省略此步。 2. 将一抗用 PBST 稀释至适当浓度（在 1.5 ml 离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验