Beyo3D™脂质过氧化检测试剂盒(BDPY 581/591

碧云天的Beyo3D™脂质过氧化检测试剂盒(BDPY 581/591 C11) (Beyo3D™ Lipid Peroxidation Assay Kit with BDPY 581/591 C11)，是一种利用荧光探针BDPY 581/591 C11 (也称BODIPY 581/591 C11)进行3D培养的细胞球或类器官中脂质过氧化检测的试剂盒。本试剂盒可快速、便捷地检测3D培养的细胞球或类器官中脂质过氧化程度的变化。通常仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞球或类器官中脂质过氧化的绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。

脂质过氧化(Lipid Peroxidation, LPO)是许多病理状态的关键变化，会导致一些重要的膜蛋白结构和功能的改变，甚至导致细胞功能障碍和广泛的细胞和组织损伤，和许多疾病的发生密切相关。广泛的脂质过氧化是铁死亡的关键下游特征。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性、与细胞凋亡不同的细胞死亡形式。在二价铁的作用下，细胞抗氧化能力减弱，细胞膜或细胞器膜上含不饱和脂肪酸长链的磷脂分子被过氧化而破坏, 造成细胞膜破裂，从而导致调节性细胞死亡(Regulated Cell Death, RCD)，也称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) [1-3]。

BDPY 581/591 C11，也称BODIPY 581/591 C11，即4,4-二氟-5-甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省-3-月桂酸，英文名为4,4-Difluoro-5-methyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoic acid，是一种具有强紫外吸收能力的小分子染料，染料间干扰小，光谱很窄，染料分子不带电荷，呈中性，其荧光峰比较尖锐，量子产率高。与大多数长波长染料不同，BDPY荧光基团本质上是亲脂性的，所以可以模拟天然脂质的性质。该系列染料在不同生理条件下相对稳定，对环境的极性和pH值相对不敏感，由于其结构具有非对称性，故有多种衍生结构产物，BDPY 581/591 C11即为其中一种。BDPY 581/591 C11的分子式为C30H35BF2N2O2，分子量为504.42，CAS号为217075-36-0，也称脂质过氧化传感器(Lipid Peroxidation Sensor)、脂质过氧化探针(Lipid Peroxidation Probe)、BDPY 581/591十一烷酸，具有良好的光稳定性、低荧光伪影特质，可以快速入膜，是一种用于检测活细胞内脂质过氧化及抗氧化能力的荧光探针。其还原态和氧化态，均具有良好的亲脂性，二者处在磷脂双分子层的两个不同区域，均不会自发离开细胞膜磷脂双分子层。BDPY 581/591 C11对各种氧自由基以及过氧亚硝酸盐灵敏，但对超氧化物、一氧化氮、过渡铁离子和氢过氧化物不灵敏[4-6]。

BDPY 581/591 C11的还原态产物最大激发波长为581nm，最大发射波长为591nm，主要为红色荧光，此时红绿荧光比值较大；经脂质过氧化氢物氧化后，激发和发射波长最大值偏移至约488/510nm，主要为绿色荧光，此时红绿荧光比值降低。实际观察时，使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可，并可通过红绿荧光的比值确定脂质过氧化的程度。

本试剂盒组分齐全，使用方便。本试剂盒提供了LpoUp作为诱导细胞内脂质过氧化物生成的阳性对照，终浓度通常为0.5-2X，最`优先的推荐终浓度为1X。同时提供了Beyo3D™ BDPY 581/591 C11 Assay Buffer，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。使用本试剂盒检测3D培养的HCT-116细胞球的效果请参考图1。

图1.碧云天Beyo3D™脂质过氧化检测试剂盒(BDPY 581/591 C11) (S1111)对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用碧云天3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (C0366)包被的U形底96孔板中培养72小时，吸除培养液后直接加入1X的Beyo3D™ BDPY 581/591 C11检测工作液，染色30分钟后，使用1X Beyo3D™ LpoUp (LpoUp)诱导细胞球2小时。结果显示，Beyo3D™脂质过氧化检测试剂盒(BDPY 581/591 C11)对于LpoUp诱导后的3D细胞染色效果清晰、明亮，正常的HCT-116细胞中BDPY 581/591 C11以还原态形式存在，呈明亮的红色荧光，绿色荧光较弱(B、C)；使用脂质过氧化的阳性对照试剂LpoUp处理后，荧光发射波长峰值从约590nm偏移至约510nm，因此活细胞内红色荧光强度显著降低，而绿色荧光显著增强(F、G)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel™基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。

本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约3小时即可完成。将本试剂盒中的Beyo3D™ BPY 581/591 C11 (1000X)按照相应比例用Beyo3D™ BDPY 581/591 C11 Assay Buffer配制成Beyo3D™ BDPY 581/591 C11检测工作液，避光孵育3D细胞球30分钟，使用脂质过氧化阳性对照试剂LpoUp等诱导处理3D细胞球后，就可进行后续的荧光显微镜拍照等荧光检测和分析。

传统的细胞培养大多以二维(Two-dimensional, 2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低[7-9]。三维(Three-dimensional, 3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果[10-11]。

3D肿瘤细胞模型越来越多地被用于了解疾病机制和药物研发。2D培养的肿瘤细胞，其单侧细胞膜可以均匀地获得营养和氧气，而3D培养的肿瘤细胞团的内部细胞获得营养和氧气的机会更少，形成自然的营养和氧气梯度，能更好地模拟体内微环境条件，因此3D培养的肿瘤球状体(Spheroid)或肿瘤类器官(Organoid)等能更好地模拟体内肿瘤，更利于小分子药物筛选或者肿瘤相关分子机制的研究，也更能准确地预测药物治疗的体内反应、疗效或毒性。同时，2D肿瘤细胞模型体外扩增有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，出现优势克隆选择性，从而降低临床相关性。相比于2D细胞模型，3D细胞球或者类器官很多情况下能提供更可信的研究结果，简化并加速药物评价流程。自2009年小肠类器官首次建立至今，3D细胞和类器官研究已经扩展到很多组织系统，并成为生命科学最热门的领域之一。

按照96孔板每孔需要100μl Beyo3D™ BDPY 581/591 C11检测工作液，本试剂盒小包装可以进行200个样品的检测，中包装可以进行1000个样品的检测。

包装清单：

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。Beyo3D™ BDPY 581/591 C11 (1000X)须避光保存，-80ºC可保存更长时间。

注意事项：

BSA和酚红(Phenol red)对本荧光探针的检测有干扰，需避免。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

本试剂盒应在无菌环境中使用，否则可能会影响检测结果。

本试剂盒仅限用于活细胞的检测。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™超低吸附黑色透明底96孔板(平底带盖, 独立包装) (FULA965)。

细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。

不同种类的细胞球对诱导剂的耐受可能存在一定的差别，3D细胞球经脂质过氧化诱导后，形态可能会发生一些变化，在染色前可以镜下观察细胞球的形态，可以酌情考虑是否选择形态比较完整的细胞球进行染色分析。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。