T-5224 | CAS#530141-72-1

CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 293FT 细胞转染验证 and trouble shooting

%；2. 72 h 后收集细胞提取基因组 DNA（按照基因组 DNA 提取试剂盒的说明书操作）；3. 使用事先设计好的引物进行 PCR 扩增，这里使用的酶是 NEB 公司的 Q5 high-fidelity Polymerase，一切按照该酶的说明书严格操作；4. 将目的条带切割下来并使用胶回收试剂盒回收 DNA 条带，一切按照胶回收试剂盒说明书进行操作；5. 回收后的 DNA 样本，经 T7 Endonuclease I 酶解验证错配 DNA，部分结果如下：T7 EI验证成功，开始正式实验时间飞逝，上次说

CRISPR-Cas9 全程实操教程：从 gRNA 设计到挑单克隆全程指导

基本原理CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫，用于降解入侵的外源 DNA。CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂，如下图所示。通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA (single guide RNA)。通过将表达 sgRNA

张峰手稿：基因工程技术之CRISPR-Cas9

transfection. Maintain the cells for another 72 hto allow suffi cient time for HR mediated by CRISPR-Cas9 systemand the template. 3.5 Verifi cation and Quantifi cation of HR Effi ciency To verify the homologous recombination between the HR