动物组织/细胞RNA快速提取试剂盒

产品描述

       本试剂盒采用了特殊的离心吸附柱和缓冲液体系，可以从动物组织/细胞中快速提取总RNA。只要25min左右即可完成提取，操作简单，使用方便。提取出的总RNA不含有蛋白和其他杂质，纯度极高，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、Poly A筛选、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。

      本动物组织/细胞RNA快速提取试剂盒通用型强，兼容性好，可广泛使用于各类组织/细胞样本的提取。目前已验证可用于提取NIH/3T3细胞、HeLa细胞、COS-7细胞、LMH细胞、Huh细胞、鼠或大鼠的胚胎、肾、肝、脾、肺、胸腺等各类细胞或组织样本。

 

产品组分

 

组分	存储	50T
平衡液	室温	10mL
Buffer RLT	室温	45mL
Buffer RW1	室温	45mL 第一次使用前请加入11mL无水乙醇
Buffer RPE	室温	11mL 第一次使用前请加入44mL无水乙醇
RNase-free H2O	室温	10mL
gDNA清除柱和收集管	室温	50套
RNA吸附柱和收集管	室温	50套

 

产品特点

1.不使用有毒的苯fen，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2.简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成。

3.适应性比较广泛，可以提取包括NIH/3T3细胞、HeLa细胞、COS-7细胞、LMH细胞、Huh细胞、鼠或大鼠的胚胎、肾、肝、脾、肺、胸腺等各类细胞或组织样本。

4.多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 典型的比值高达 2.1～2.2，基本无 DNA 残留，可用于RT-PCR，Northern-blot 和各种实验。

 

运输和保存方法

1.本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。

2.试剂盒储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

 

典型的细胞/组织RNA产量

 

不同细胞或组织中RNA含量

细胞名称（1×106细胞）	总RNA的产量（μg）
NIH/3T3	10
HeLa	15
COS-7	35
LMH	12
Huh	15
组织名称（10mg大鼠/小鼠组织）	总RNA的产量（μg）
胚胎（13天）	25
肾脏	20-30
肝	40-60
脾	30-40
胸腺	40-50
肺	10-20

 

注意事项

1、实验过程使用的离心机均可在4℃进行，转速可以达到12,000rpm的传统台式离心机

2、需要自备乙醇、β-巯基乙醇或者DTT和研钵。

3、样品处理量不能超过离心柱的处理能力，否则容易导致DNA残留或者RNA产量降低

4、RLT和RW1中含有刺激性化合物，操作时务必戴手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5、样品处理量不要超过吸附柱处理能力，否则造成 DNA 残留或者产量降低。不同组织细胞种类 RNA/DNA 相差较大，例如胸腺脾脏 DNA 含量丰富，超过 5mg就会超过柱子处理能力。COS 细胞 RNA 含量丰富，超过 3x10⁶ 细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品 DNA/RNA 含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过 3-4×10⁶，组织不超过10mg。后续根据样品试验情况增加或者减少处理量。

6、关于DNA的微量残留：

一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留（DNase 消化也无法做到 100%无残留），本公司的 RNA 提取产品，由于采取了本公司特殊的裂解液体系和离心管吸附柱技术，绝大多数 DNA 已经被清除，不需要 DNase 消化，可直接用于RT- PCR 和qPCR。个别特殊情况如 DNA 含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA 表达量分析荧光定量 PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

（1）选用跨内含子的引物，以穿过 mRNA 中的连接区，这样 DNA 就不能作为模参与扩增反应。

（2）选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。

（3）在步骤去蛋白液 RW1 漂洗前，直接在离心柱上进行 DNase I 柱上消化处理。购买 DNA 酶柱上消化试剂盒(货号：HRN0291)前可先索取具体操作说明书。

7、RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5 kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的 OD260/OD280 读数1.8-2.1之间，

在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计

调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

8、本产品仅作科研用途！

 

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在  Buffer  RPE ， Buffer  RW1 中添加指定量的无水乙醇 ，并做好标记！

→在使用前加入  10μL β-巯基乙醇或 20μL 的 2 M DTT 到 1mL Buffer RLT 中 ，含有β-巯基乙醇或者DTT 的裂解液可在室温下保存长达 1 个月。

（一） 、组织培养细胞

1、柱平衡：  向吸附柱中加入  100μL  的平衡液  ，  12,000   rpm 离心    1 min  ，弃滤液  ，柱子备用

2、 收集＜ 107 悬浮细胞到一个 1.5 mL 离心管 ，对于贴壁细胞 ，孔板培养可以直接裂解 ，细胞培养瓶培养的 ，应该先用胰酶消化后吹打下来收集。

3、 6000rpm离心 2min ，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清 ， 留下细胞团 ，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量和纯度降低。

4、轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬 ，加入 350μL（＜5 × 106 细胞  ）或 600μL（ 5 × 106 -1 × 107细胞） 裂解液  Buffer  RLT ， 吹打混匀后用手剧烈振荡 1min充分裂解。

5、匀浆：（处理细胞量极少时＜ 1 × 105 一般不需要 ，涡旋振荡 1 min 匀浆） 。用钝针头的一次性  1 mL(配  0.9 mm  针头)  注射器剧烈抽打裂解物 10 次以上或直到得到满意的匀浆结果（或者电动匀浆30 秒） ，可以剪切 DNA ， 降低粘稠度防堵塞柱子和提高含量。

6 、将裂解混合物或匀浆混合物全部加到 gDNA 清除柱上（清除柱放在收集管内） 。

7、立刻  12,000 rpm 离心 60 秒 ，保留滤过液（ RNA 在滤过液中）。

8、 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为  350μL/600μL ，滤过时候损失体积应该减去） ，加入等体积的 70%乙醇 ，此时可能出现沉淀 ，但不影响提取过程 ，立即吹打混匀 ，不要离心。立刻将混合物（每次小于 700μL ， 多可以分两次加入） 加入到 RNA 吸附柱中 ， 吸附柱放入收集管中 ，立刻  12,000rpm 离心 30 秒 ，弃掉废液。

9、加入 700μL  Buffer RW1 ，室温放置 1min ， 12,000rpm 离心 30 秒 ，弃掉废液。

10 、加入 500μL Buffer RPE（使用前请检查是否已经加入无水乙醇） ， 12,000rpm 离心 30 秒 ，弃 掉废液 ，再次加入 500μL Buffer  RPE ，重复一遍。

11、将 RNA 吸附柱放回空收集管中 ， 12,000 rpm 离心 2 min ，尽量除去漂洗液 ， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12、去除 RNA 吸附柱 ，放入全新的无酶离心管中 ，在吸附膜的中间部位加入 30-50μL 无酶水 ，室温放置 1 min ， 12,000rpm 离心  1 min ，离心管中获得的液体就是 RNA。

如果预期 RNA 产量>30μg ，加 30-50μL  无酶水重复步骤   12 ，合并两次洗脱液 ，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度高)。

洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高 ，分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高  15-30% ，但是浓度要低。

（二） 、动物组织（例如鼠肝脑）

1、柱平衡：  向吸附柱中加入  100μL  的平衡液  ，  12,000   rpm 离心    1 min  ，弃滤液  ，柱子备用

2、 电动匀浆 ：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块 ，加入 350μL( <20mg  组织)或者  600μL(20-30mg组织)的裂解液  Bufffer RLT 后电动彻底匀浆 20-40 秒。

3、液氮研磨和匀浆 ：组织在液氮中研磨成粉 ，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有  350μL/600 μL  组织裂解液  Bufffer RLT  的   1.5 mL  离心管中 ，用手剧烈振荡 1min ，充分裂解。用带钝针头的一次性 1 mL(配  0.9 mm  针头)  注射器剧烈抽打裂解物   10  次或直到得到满意匀浆结果(或者电

动匀浆 30 秒) ，可以剪切 DNA ， 降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。

4、将匀浆后裂解物 12,000rpm  离心  3 min ，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物 ，将裂解物上清全部加到 DNA 吸附柱上（吸附柱放在收集管内组装好） 。

5、立刻  12,000 rpm  离心  60  秒 ，保留滤过液（ RNA  在滤过液中）。

6、 用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为  350μL/600μL ，滤过时候损失体积应该减去） ，加入等体积的  70%乙醇 ，此时可能出现沉淀 ，但不影响提取过程 ， 立即吹打混匀 ，不要离心立刻将混合物（每次小于  700μL ，多可以分两次加入） 加入到  RNA  吸附柱中 ， 吸附柱放入收集管中 ，立刻  12,000rpm  离心  30  秒 ，弃掉废液。

7、加入  700μL Buffer  RW1 ，室温放置  1min ， 12,000rpm  离心  30  秒 ，弃掉废液。

8、加入  500μL Buffer RPE（使用前请检查是否已经加入无水乙醇） ， 12,000rpm  离心  30  秒，弃掉废液 ，再次加入  500μL  Buffer RPE ，重复一遍。

9、将  RNA  吸附柱放回空收集管中 ， 12,000 rpm  离心  2min ，尽量除去漂洗液 ， 以免漂洗液中残

留乙醇抑制下游反应。

10、去除  RNA  吸附柱 ，放入全新的无酶离心管中 ，在吸附膜的中间部位加入  30-50μL  无酶水，室 温放置  1min ， 12,000rpm  离心   1min ，离心管中获得的液体就是   RNA。

如果预期  RNA  产量>30μg ，加  30-50μL  无酶水重复步骤  12 ，合并两次洗脱液 ，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要  RNA  浓度高)。

洗脱两遍的  RNA  洗脱液浓度高 ，分两次洗脱合并洗脱液的  RNA  产量比前者高  15-30% ，但是浓度要低。

注：55℃预热RNase-free H2O可提高回收产量

附表1：贴壁培养细胞数量表

培养器皿	底面积（cm2）	加培养液量（mL）	可获细胞量
24 孔培养板	2	1	2.5×105
6 孔培养板	9.5	2.5	1×106
35mm培养皿	8	3	1×106
60mm培养皿	21	5	2.5×106
25cm2塑料培养瓶	25	5	5×106