Strep-tag II蛋白纯化试剂盒(30-150μm)

产品简介
Strep-Tag 系统是模拟链霉亲和素-生物素系统的新型蛋白纯化系统，Strep-Tactin 对 Strep-Tag II 的亲和能力与链霉亲和素相比，至少强 10 倍以上，且分离纯化条件温和，在生理条件下即可实现蛋白的分离纯化；此外，与其他 tag 相比，Strep-Tag II 为 8 个氨基酸的小标签（WSHPQFEK），由于标签小，仅为 1 kDa 左右，不影响融合后蛋白质的结构和功能。这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性，并仅经一步提取即可产出超过 99%的纯度。Magrose Strep-Tactin 磁珠采用特殊的蛋白偶联工艺，将 Strep-Tactin 蛋白共价偶联到超顺磁性磁珠表面，制备了一种专为高效、快速分离纯化Strep-tag II 蛋白的一种新型功能化材料，实现并搭建了提取速度、提取量及纯度兼得的蛋白纯化平台。

产品信息

产品名称：   Magrose Strep-Tactin
组分

磁珠粒径：   30~150μm
配基含量：   ~6mg Strep-Tactin /mL Gel
融合蛋白结合量：   ~7mg Strep-tag II 蛋白 /mL Gel
悬液浓度：   10%（ V/V）磁珠悬液
保存液：   1×PBS,含 0.1%Tween-20,含 0.1% Proclin 300
保存温度：   2~30°C （长期保存，建议置于 2~8°C）
保质期：   2年
Binding/Washing Buffer：   10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA,含 0.03% Proclin 300, pH 8.0
Elution Buffer：   2.5mM desthiobiotin in Binding Buffer
Regeneration Buffer：   0.5M NaOH or 1mM HABA in Binding Buffer

注 1：磁珠蛋白结合量与目标蛋白特性相关，此处仅做参考值。

适用范围
可用于从任何表达系统，包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中含有 Strep-Tag II 标签蛋白的分离纯化。

操作流程
目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。以下提供一个较为广泛应用的 Strep-Tag II 蛋白的纯化流程，用户可参考该操作流程，或者根据自己蛋白的特性自行设计和优化蛋白纯化流程。

1. 缓冲溶液配制
Binding/Washing Buffer ：10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0
Elution Buffer：2.5mM desthiobiotin in Binding Buffer

2. 样品处理
本《用户手册》提供以下三种样品的处理方法：
(1) 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量 Binding Buffer 稀释，加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为 1mM 的 PMSF）；冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗
样品中加入适量核酸酶，在冰上放置 30min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。
(2) 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量 Binding Buffer 稀释平衡，即为粗蛋白样品。
(3) 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量 PBS 洗涤 1 次，弃上清；用适量含 1%（V/V）Triton X-100 或 1%（V/V）NP-40 的 Binding Buffer 重悬；加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为 1mM 的PMSF）；置于冰上 10min，即为粗蛋白样品。

3. 磁珠预处理
一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250mL 发酵液收获 1 g 湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为~7 mg，用户需要取 10mL 10%的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明：
(1) 将磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取 10mL 磁珠悬液于离心管中；
(2) 将离心管置于磁性分离器上，待溶液变澄清后，移去上清液；
(3) 加入 5~10mL Binding Buffer/Washing Buffer 到上述装有磁珠的离心管中，盖紧盖子，漩涡振荡 15 s，使磁珠重新悬浮。将离心管置于磁性分离器上，磁性分离＊，移去上清液，重复洗涤 2 次。
（*注：在磁性分离过程中，为了减少磁珠在使用过程中的损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁性分离器上，手持磁性分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新变澄清；以下同。）

4.目标蛋白与磁珠结合
(1) 用 10mL Binding Buffer 重悬 1g 湿重的菌体，进行破碎和裂解后，即为粗蛋白样品；
(2) 将粗蛋白样品转移到装有已预处理磁珠的离心管中，盖紧离心管盖；
(3) 将离心管置于漩涡混匀器振荡 15s，然后将其置于垂直混合仪上，室温垂直混匀 30min（如果需要，可在 2~8℃的低温环境下旋转混合约 1h，防止目标蛋白降解）；
(4) 将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液到新的离心管中以备后续检测。从磁性分离器上取下离心管进行下一步洗涤步骤。

5. 磁珠洗涤
(1) 将步骤 4 的磁珠中加入 5~10mL Washing Buffer，漩涡混合 2min，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测；
(2) 继续将上述磁珠中加入 5~10mL Washing Buffer，漩涡混合 2min，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移至新的离心管，避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白；磁性分离，移出上清液到收集管，以备取样检测；

6. 目标蛋白洗脱

(1) 加入 2~5mL Elution Buffer（用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度）于离心管中，盖紧离心管盖，然后将离心管置于垂直混合仪上，室温垂直混合洗脱 10min；磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品；
(2) 如果需要，可以重复上述步骤 1 次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。

7. 磁珠再生和保存
(1) NaOH 再生：洗脱目的蛋白后的磁珠按照以下顺序进行洗涤： 5~10mL 纯化水洗涤 3 次、5~10mL 0.5M NaOH 洗涤 3 次、5~10mL 纯化水洗涤至中性，最后加入 10mL 保存液，将磁珠放置 2~8℃环
境保存。
(2) HABA 再生：用脱硫生物素洗脱目标蛋白的磁珠还可以用 HABA 缓冲液再生，加入 5~10mL 1mM HABA 洗涤磁珠 5 次，接着用 Binding Buffer 洗涤磁珠至磁珠本身颜色，每次洗涤 5min，最后加入
10mL 保存液，将磁珠放置 2~8°C 环境保存。

蛋白纯化流程的优化
以上操作流程适用于大部分 Strep-Tag II 标签蛋白的纯化，根据目标蛋白与 Strep-Tactin 蛋白纯化磁
珠的结合性能不同，用户可以从以下几个方面对纯化流程进行优化，以提高目标蛋白的回收率和纯度。

1. 提高目标蛋白回收率的参考方法
(1) 延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间；
(2) 添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(3) 增加磁珠用量；
(4) 延长洗脱目标蛋白的时间或增加洗脱次数；

2. 提高目标蛋白纯度的参考方法
(1) 在纯化过程中添加合适的蛋白酶抑制剂，防止目标蛋白降解；
(2) 延长洗涤的时间，增加洗涤次数；

注意事项
(1) 首次使用本产品前，请务必详细阅读本用户手册；
(2) 磁珠使用和保存过程中应避免冷冻、干燥和高速离心等操作；
(3) 在使用本产品前，请务必充分振荡使磁珠保持均匀的悬浮状态；
(4) 请选用质量好的移液器吸头和离心管，以免磁珠贴壁或混合过程发生渗漏引起磁珠的损耗；
(5) 磁珠与溶液混合过程中，如果溶液粘稠无法通过翻转离心管重悬磁珠，可采用移液器反复吹吸或短时漩涡混合使磁珠充分重悬；
(6) 用户可根据实际需要保留经磁性分离移去的上清液，进行取样检测，以便分析纯化过程和优化蛋白纯化流程；
(7) 本产品可以重复使用，重复使用时，建议纯化同种蛋白，纯化不同种类的蛋白时，建议使用新的磁珠，以防交叉污染；
(8) 本产品需与磁性分离器配套使用；
(9) 本产品仅供研究使用。