猪凝血酶原Ⅱ(PTⅡ)ELISA试剂盒

猪凝血酶原Ⅱ(PTⅡ)ELISA试剂盒
简介
多凝血酶原Ⅱ（Prothrombin，PTⅡ）是血液凝固过程中的一种关键因子，也称为凝血酶原，它是一种多域糖蛋白，在肝脏中合成，并在血液循环中以“闭合”和“开放”两种形式存在，其中约80%为“闭合”形式。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物PTⅡ，清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中PTⅡ的浓度。
操作要点及注意事项
1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。
2. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。
3. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。
4. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。
5. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。
6. 此试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。
7. 该试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。
8. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。
9. 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品。处理后彻底洗手。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。洗涤液/稀释液配置：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从320ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至16ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的16ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将16ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为:  16ng/mL、 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。

抗体工作液配置 
使用前10分钟，将100×生物素化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×生物素化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置 : 
使用前10分钟，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。
备 注：如待测样本中PTⅡ浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。
结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果。
实验步骤
所有标准品、样品建议复孔检测
1. 酶标板准备：确定试验所需要的孔数，取下未使用的酶标条放回装有干燥剂的铝箔袋。
2. 样本孵育：每孔分别加入100μL不同浓度的标准品以及预处理过的待测样品（建议样本用通用稀释液最少稀释1倍上样，目的是减少基质效应），盖上封板胶纸，37℃避光反应1 h。孵育结束后，每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液，轻轻晃动30秒，甩干并在纸上拍干，以这种方式清洗3次。
3. 抗体孵育：每孔加入100μL生物素化抗体工作液，轻轻混匀，盖上封板胶纸，37℃避光反应1h。孵育结束后，重复步骤2中的清洗方式清洗4次。
4. 酶标孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，盖上封板胶纸，37℃避光反应30分钟，清洗4次，拍干。
5. 底物显色：每孔首先加入50μL显色液A，随后加入50μL显色液B，轻轻混匀，盖上封板胶纸，37℃避光反应15分钟。
6. 终止反应：待显色反应结束后，每孔加入50μL终止液，轻轻混匀，5分钟内用预热完成的酶标仪在450nm处测吸光值。
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.13ng/mL。
特异性
该试剂盒测定可识别重组猪PTⅡ。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
注意事项
本公司提供的猪凝血酶原Ⅱ(PTⅡ)检测试剂盒检测范围、灵敏度等实验数据，因检测样本的不同会有所调整，实际数据以随货说明书为准。
Porcine PTⅡ ELISA KIT产品仅供教研使用，用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中猪PTⅡ。
回收率
回收率在不同基质的整个测定范围内选取在健康猪血清、血浆和细胞培养上清中加入3个不同浓度水平计算回收率。

线性关系
分别在选取的4份健康猪血清、血浆和细胞培养上清中加入高浓度PTⅡ，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。