Cell Cycle and Apoptosis Analy

产品描述

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）是一款采用经典的碘化丙啶染色法进行细胞周期和细胞凋亡分析的试剂盒，通过流式细胞仪进行分析。本试剂盒通常用于贴壁细胞或悬浮细胞的细胞周期与凋亡检测。对于组织样品，需经消化成单细胞后才可用此试剂盒进行检测。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种靶向双链DNA（dsDNA）的荧光探针，这种结合没有或几乎无序列偏向性。PI与dsDNA结合后产生荧光，且荧光强度和dsDNA的含量成正比。细胞经PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么，含双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度介于1-2。而凋亡细胞由于细胞核发生浓度以及DNA片段化导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失，因此，凋亡细胞PI染色明显很弱，即荧光强度＜1，在流式细胞检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。因此，通过流式细胞仪可对细胞DNA含量进行测定，并且根据染色DNA含量的分布情况，进行细胞周期和凋亡分析。

另外，细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩，细胞核碎裂，产生凋亡小体，使得细胞的光散射性质产生变化。在凋亡早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增强或无变化。在凋亡晚期，前向和侧向光散射的信息均降低。因此，可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡情况。

保存与运输方法

保存：染色缓冲液+4℃保存，PI染色液+4℃避光保存，RNase A-20℃保存，一年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 因碘化丙啶（PI）也能结合RNA，因此，试剂盒内提供RNase A用来降解RNA，以降低背景荧光。

2） 因碘化丙啶（PI）不具有细胞膜渗透性，则需先对进行乙醇固定，再进行后续染色。

3） 请自行准备95%乙醇和PBS。

4） 荧光染料均存在荧光淬灭，保存和使用过程中请注意避光，以减缓淬灭。

5） 因碘化丙啶（PI）对人体有刺激性，请注意适当防护。

6） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步骤

1.1 细胞样品的准备：每个样品的细胞数量可以为10~100万。

a）对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一干净离心管内备用。 用胰酶消化细胞，直至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。再次加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。

b）对于悬浮细胞：1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入1ml 冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50µl左右的PBS，以避免吸走细胞。再次加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞。

c）对于组织样本：用剪刀将组织剪成尽量小的小块后，用0.25%胰酶消化30-60min（或根据实际情况选择适当的混合酶来进行组织消化），经过200-400目细胞筛网过滤得到单细胞悬液。然后参照步骤b）对于悬浮细胞来准备样品。

1.2 细胞固定：取4ml冰浴预冷的95%乙醇，一边低速涡旋震荡的同时逐滴加入1ml细胞悬液（冰上操作），混匀后于4℃固定2h或更长时间，固定12~24h可能效果更佳。1000rpm离心5min沉淀细胞。对于特定的细胞，如果无法完全离心至管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心速度。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的乙醇固定液，以避免吸走细胞。加入约5ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50µl左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹动离心管底以分散细胞避免细胞成团。

1.3 PI染色工作液的配制：参照下表根据实际检测样本的数量配制足量的PI染色工作液【注意：PI染色工作液短时间可4℃保存，但需当日使用】。

1.4 染色：每管细胞样品中加入0.4ml PI染色工作液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光孵育30min。随后可置于4℃或冰浴避光存放。染色完成后请在24h内完成流式检测，最好能在当天完成流式检测。

1.5 流式检测与分析：用流式细胞仪（通常F2通道）在激发波长488nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行DNA含量和光散射分析。