Hoechst 33342/PI Double Stain

产品描述

Hoechst 33342/PI细胞凋亡双染试剂盒（Hoechst 33342/PI Double Stain Kit）是一种采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）双染进行细胞凋亡与坏死分析的检测试剂盒。检测原理在于：Hoechst 33342是一种活细胞核染料，能穿透正常细胞以及凋亡细胞膜，与DNA结合（最大激发波长为350nm，发射波长为461nm），呈现蓝色荧光。当细胞发生凋亡，染色质发生固缩，染色后的细胞荧光比正常细胞明显增强。而PI是一种死细胞核染料，不能穿透细胞膜，对于具完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。但对于坏死细胞，由于膜的完整性丧失，PI能够穿透进入细胞，与DNA结合（最大激发波长为536nm，发射波长为617nm），呈现红色荧光。经Hoechst 33342/PI双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测，正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光；凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光；坏死细胞为强红色荧光+弱蓝色荧光。

本试剂盒可检测100个样品，每个样本的细胞数量可为0.1~1×10⁶。

保存与运输方法

保存：-20℃保存，1年有效。使用频繁可置4℃保存，5个月有效。Hoechst染色液和PI染色液需避光保存。

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 荧光染料均存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

2） Hoechst 33342孵育细胞时间不宜过长，一般控制在20min内。太长容易引起探针的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变。

3） PI对人体有一定的刺激性，请注意适当防护。

4） 如果要进行组织的凋亡和坏死检测，请将组织消化制备成单细胞悬液后再检测。

5） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

保存与运输方法

保存：-20℃干燥保存，2年有效。 

运输：室温运输。

注意事项

1）本品不是临床药物，只能用于科研用途，不能用于诊断或临床用途。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、细胞样本制备

1.1贴壁细胞

1.1.1 小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用；

1.1.2 用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以轻轻用移液枪或枪头吹打下来，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有贴壁细胞，并轻轻吹散细胞

1.1.3 收集上述细胞悬液到离心管内，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底，小心吸取上清并丢弃，可留约50μl培养液，以免吸走细胞。【注意】：某些特殊细胞，如果沉淀不充分，可以适当提高离心力或者延长离心时间。

1.1.4 加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml无菌离心管，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底。

1.1.5 小心吸取上清并丢弃，可留约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

1.2 悬浮细胞

1.2.1 4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底，小心吸取上清并丢弃，可留约50μl培养液，以免吸走细胞。

1.2.2 加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5ml无菌离心管，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底。

1.2.3 小心吸取上清并丢弃，可留约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

二、染色前制备

2.1细胞染色缓冲液（1×）的准备：取适量细胞染色缓冲液（2×）与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为细胞染色缓冲液（1×），4℃保存备用。

2.2 细胞重悬：将上述收集好的0.1~1×06细胞，加入0.9ml细胞染色缓冲液（1×），重悬细胞沉淀。

三、Hoechst 33342/PI双染

3.1加入5μl Hoechst 33342染色液，置于37℃水浴，孵育5~15min。

3.2置于冰水冷却，4℃，1000g离心3~5min，使细胞沉至管底，弃上层染色液。

3.3加入0.9ml细胞染色缓冲液（1×），重悬细胞沉淀。

3.4加入5μl PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。

【注意】：也可一步法进行染色：加入5μl Hoechst 33342染色液和5μl PI染色液，轻轻混匀，置于冰浴或4℃，孵育20~30min。

四、结果分析

4.1流式细胞仪检测

用流式细胞仪在激发波长400~500nm处检测蓝色荧光，在＞630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

4.2荧光显微镜检测

检测前，4℃，1000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色和蓝色荧光。

【注意】：对于贴壁细胞，也可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入细胞染色缓冲液（1×）、Hoechst 33342染色液、PI染色液，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。染色后，PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。

4.3 结果呈现

正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光；坏死细胞呈低蓝光/高红光。