pCDNA3.1-Aimp1-m-6×His小鼠基因质粒

一种优化的PCR 方法——降落PCR 扩增目的基因

温度越来越低[2 ] ,从而达到最佳扩增条件的方法。我们在构建人 CD137 - hIgG1Fc - pCDNA3 融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV DNA 多聚酶基因突变的过程中运用降落PCR 进行了扩增目的基因的尝试。1 　材料和方法1.1 　质粒含有人CD137 全长cDNA 序列的pCDNA3 质粒(CD137 - pCDNA3) ,由Herbert Schwarz 教授惠赠; 含hIgG1 FccDNA的PGEM - T质粒由第二军医大学曹雪涛教授惠赠; HBV DNA ,从6 位慢性HBV 感染者血清

核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达

-MEM、DMEM培养基和M-MLV逆转录酶；小牛血清；G418；DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I1。 质粒 pGL3-promoter；含EBVR的质粒p220.2。 重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR的构建 采用StuI和XbaI消化p220.2，获得长4.7 kb的EBVR，包括EBV核抗原1(EBNA1)和OriP，克隆至pGL3-promotor的SV40启动子下游Hind Ill

真核转染

、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌