5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)ELISA试剂盒

实验原理
本试剂盒采用双抗体夹心两步法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗检测蛋白抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入牛检测蛋白校准品和待测样本，再加入生物素标记抗体，经过温育与充分洗涤后，再加入HRP偶联的亲和素，经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-生物素标记抗体-亲和素酶的夹心复合物。加底物A和B，产生蓝色产物，在终止液作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中检测蛋白的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中检测蛋白的浓度。
试剂盒组分与保存
组分    开封后储存    组分    开封后储存
校准品    2-8℃14天    底物液B    2-8℃180天
包被微孔板    2-8℃14天    终止液    2-8℃180天
生物素抗体    2-8℃180天    20×浓缩洗涤液    2-8℃180天
HRP标记亲和素    2-8℃14天    说明书    --
样本稀释液    2-8℃180天    自封袋    --
底物液A    2-8℃180天    不干胶    --

操作程序
所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3、设置标准品孔、样本稀释液孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本稀释液孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。除空白孔外，每孔加入生物素抗体100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育60min。
4、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
5、除空白孔外，每孔加入HRP标记亲和素100uL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育20min。
6、重复步骤4。
7、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光温育15min。
8、所有孔加入终止液50μL，在450nm波长酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
结果计算
9、以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。【用ELISA Calc软件计算】
10、如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。
经典数据
（1）标准曲线：
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。每次检测，每块酶标板都必须设立标准曲线。


（2）精密度：
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。
（3）灵敏度：
最低检出剂量小于15.63 pg/mL(6 次独立实验的平均值)。
10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD，计算最低可检测浓度。
（4）回收率：
分别往不同样本中添加已知的高、中、低浓度目的蛋白样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在85%-115%之间。
（5）稀释线性：
将添加有高浓度检测蛋白的样本分别稀释 2 倍，4 倍，8 倍，16 倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率在80%-120%之间。