细胞ROS活性氧检测|组织活性氧ros检测|细胞实验

活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)是一类化学性质活泼的含氧分子，包括超氧阴离子(O₂⁻·)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(·OH)等。它们在细胞信号传导、免疫防御等方面具有重要作用，但过量积累会导致氧化应激，引发脂质、蛋白质及DNA损伤，与衰老、炎症、肿瘤、神经退行性疾病及心血管疾病密切相关。

流式细胞术检测细胞内ROS可在单细胞水平快速、定量地分析不同处理条件下的氧化应激水平，并能区分细胞亚群的异质性反应，是研究氧化还原调控机制及药物抗氧化效应的核心工具之一。

原理

核心机制：荧光探针与ROS的可逆或不可逆反应

流式ROS检测依赖于ROS敏感的荧光探针，这些探针进入细胞后可与特定ROS发生化学反应，改变荧光强度或波长，从而反映ROS水平。

常用探针类型及原理：

1. DCFH-DA(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)​

非荧光脂溶性AM酯，可穿透细胞膜;在胞内酯酶作用下水解为DCFH(极性，滞留胞质);

DCFH被ROS(尤其是H₂O₂、·OH)氧化生成高荧光DCF(激发488nm，发射525nm);

优点：灵敏度高，适用于大多数细胞;缺点：对多种ROS无选择性，易受光照与金属离子干扰。

2.DHE(Dihydroethidium)​

红色荧光探针，优先与超氧阴离子(O₂⁻·)反应生成Ethidium(插入DNA呈红色荧光，Ex/Em≈518/605nm);

常用于检测O₂⁻·为主的氧化应激。

3.CM-H₂DCFDA​

DCFH-DA的衍生物，带氯甲基基团，可减少胞外氧化与非特异性染色，提高特异性。

HPF(Hydroxyphenyl fluorescein)、APF(Aminophenyl fluorescein)​

对次氯酸根(HOCl/OCl⁻)或过氧亚硝基(ONOO⁻)等特定ROS具有高选择性。

流式检测逻辑：

细胞经探针负载后，在特定时间点(刺激前后)用流式细胞仪检测荧光强度，荧光值与ROS水平正相关;可绘制直方图或散点图，统计平均荧光强度(MFI)、ROS阳性细胞百分比及荧光分布，进行定量分析或分组比较。

步骤

1. 细胞准备：贴壁细胞铺板至合适密度;悬浮细胞离心收集(1×10⁶~5×10⁶ cells/mL)。
2. 探针负载：细胞重悬于含探针(5~10μM)的无血清培养基/HBSS，37℃避光孵育20~30min;离心清洗2次去除未进入胞内的探针。
3. 基线检测：重悬细胞于预热缓冲液，上机检测基线荧光(Time 0)。
4. 刺激与检测：加入刺激剂(如H₂O₂ 200μM)，继续避光孵育15~60min(依探针动力学而定);在不同时间点采集荧光信号。
5. 数据分析：计算平均荧光强度(MFI)、ROS阳性细胞比例;绘制时间-荧光曲线;对比不同处理组差异(*p<0.05)。

样本类型及运输

1. 样本类型

• 原代细胞：神经元、肝细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等(需新鲜分离，避免长时间离体导致ROS基线升高)。
• 细胞系：贴壁(如HepG2、A549、RAW264.7)或悬浮(如J774A.1、K562)。
• 临床样本：PBMC(需快速分离并置于无血清培养基防氧化)、穿刺组织解离的原代细胞。

2. 运输要求

• 短期(<12h)：4℃冷藏，悬浮细胞用含缓冲液的管密封，避免气泡与光照。
• 长期：液氮冻存(-196℃)，运输用干冰，避免反复冻融。

注意：运输过程应避光、防震，保持细胞活性;贴壁细胞运输需保湿并尽快铺板。