Uracil-DNA Glycosylase (E. col

Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)(5U/µl) 产品介绍 本公司生产的 Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)，也称 E. coli Uracil-DNA Glycosylase (UDG)或 E. coli Uracil N-Glycosylase (UNG)，即大肠杆 菌 UDG 或 UNG，可催化含尿嘧啶的 DNA 链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的 N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有 dU 的单链或双链 DNA，但不能水解 RNA 或含有 dU 的长度不超过 6 个碱基 DNA 寡聚体。UDG 主要应用于消除 PCR 扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：在 PCR 反应中加入适量的 dUTP，以 dUTP 替代 dTTP 掺入 DNA 中，形成含 dU 碱基 的 PCR 扩增产物；后续进行 PCR 反应时，使用 UDG 酶选择性切割可能被污染而带入的之前 PCR 扩增产生的含有 dU 的单链或双链 DNA，从而避 免之前的 PCR 扩增产物可能的污染对于本次 PCR 扩增带来的负面影响。   来源（Source） 大肠杆菌重组表达 外观（Appearance） 无菌液体 保存液（Storage Buffer） 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol 酶浓度（Enzyme Concentration） 5U/μL 纯度（Purity） 不含 UDG 酶活力之外的内切或外切脱氧核糖核酸酶、RNase 和磷酸酶活性。 活性定义（Activity Definition） One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of 60 pmol of uracil per minute from double-stranded, uracilcontaining DNA. Activity is measured by release of [3H]-uracil in a 50 µl reaction containing 0.2 µg DNA (104–105 cpm/µg) in 30 minutes at 37℃.   组分和说明 组分 MB01029-1KU MB01029-5KU E. coli UDG (5U/µl) 200µl 1ml 10X E. coli UDG Buffer 1ml 10ml 说明书 1份   产品应用 防止 PCR 产物的交叉污染；单核苷酸多态性检测(single nucleotide polymorphism detection，GMPD)；位点特异性突变；蛋白质与 DNA 相互 作用研究；SNP 基因分型；PCR 产物的克隆；制备含有单链突出末端的 PCR 产物或 cDNA。 产品优势 Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有 dU 的单链或双链 DNA，还用于消除 PCR 扩增过程中带来的产物污染问题 使用说明 1.PCR 反应体系的设置： 参考下表设置 PCR 反应体系，或者参考所使用的 PCR 扩增体系设置 PCR 体系，并加入 E. coli UDG 酶至终浓度为 0.01U/μl。通常仅加 入 PCR buffer 即可，无需加入 UDG 的 buffer。 Reagent Volume Volume Final Concentration Nuclease-Free Water (18.325-x)μl (36.65-y)μl - 10X PCR Buffer (with Mg2+) 2.5μl 5μl 1X (1.5mM Mg2+) dNTP/dUTP (2.5mM each/5mM) 2μl 4μl 0.2mM each/0.4mM Primer mix (10μM each) 2μl 4μl 0.8μM Template xμl yμl 10pg-1μg Taq DNA Polymerase (5U/μl) 0.125μl 0.25μl - E. coli UDG (5U/µl) 0.05μl 0.1μl - Total volume 25μl  50μl - 注 1：根据实验需要，dNTP/dUTP (可购买 MB01028 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM))的终浓度可在 0.2-0.6mM 之间调整。 镁离子的最终终浓度可在 1.0-4.0mM 之间调整。 注 2：对于 25μl 的 PCR 反应体系，E. coli UDG (5U/µl)的使用量一般为 0.25-0.5U。 注 3：模板和引物的用量请参考 MB01001 Taq DNA Polymerase 使用说明或相应的 PCR 体系的产品说明书。 2.参考上述反应体系，加入 E. coli UDG 后混匀，37℃孵育 10min (本步骤可以有效去除可能的之前含 dUTP 的 PCR 扩增产物的污染)， 后续就可以立即进入 PCR 扩增程序(须确保退火温度不低于 55℃)。根据我们的实际测试结果发现，在退火温度不低于 55℃的情况下，使 用本产品的情况下不会影响 PCR 扩增的产物量。 保存条件： -20℃保存，≤0℃运输 注意事项： （1）E. coli UDG 酶在大多数 PCR 反应缓冲液体系中均有活性，但对于自行使用的 PCR 或 RT-PCR 体系，首次使用时建议先测试一下是否和所使 用的体系兼容。通常取含 dUTP 的 PCR 扩增产物，加入适量 UDG，观察能否有效降解含 dUTP 的 PCR 扩增产物。 （2）dNTP/dUTP 推荐选购浦斯瑞的 MB01028 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)。 （3）由 E. coli UDG 酶消化产生的 DNA 链的无碱基位点可通过加热，碱处理或核酸内切核酸酶处理而除去。通常 PCR 反应过程中的加热步骤可以 确保 UDG 酶消化的位点被完全剪切开。 （4）E. coli UDG 酶在比较宽泛的 pH 范围内具有活性，其最适 pH 值为 8.0，E. coli UDG 酶活不需要二价阳离子，并被高离子强度(> 200 mM)所 抑制。 （5）E. coli UDG 酶可以在 PCR 反应前清除不慎污染的含 dUTP 的 PCR 产物，从而避免由于污染导致的 PCR 假阳性结果。 （6）E. coli UDG 在加热变性后可能由于重折叠而在较低温度下表现出残留活性。因此，建议在退火步骤中使用 55℃或更高的温度进行后续 PCR。 （7）E. coli UDG 可以用于 DNA 或 cDNA 的常规 PCR 或 qPCR 扩增体系，但通常不建议用于 RT-PCR 体系。因为在反转录条件下，通常 E. coli UDG 会保持活性，并可能消化新合成的 cDNA。 （8）E. coli UDG 酶经 95℃加热 10min 处理后，仍会保持少量活性，如果希望用于 RT-PCR 体系，需要反转录和 PCR 分开进行，在反转录时不使 用 dUTP，在反转录后加入 E. coli UDG 酶处理，然后进行常规的 PCR 或 qPCR，或者建议加入 UDG 抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体 PBS2 的 Ugi 蛋白或噬菌体 phi29 的 p56 蛋白)进一步抑制 E. coli UDG 的酶活性。 （9）本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 （10）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。