T3体外转录试剂盒

体外转录实用技巧

。） 使用不同的聚合酶 通常用于体外转录的三种 RNA 聚合酶可以相互不同地转录给定的模板。当转录不能完成时，可以充分利用这种转录给定模板序列的不同能力。改变转录模板前面的聚合酶启动子序列是一种劳动密集型修复，因为它可能需要设计 PCR 引物或亚克隆。Ambion 具有可简化过程的载体和引物。pTRIPLEscript 系列载体具有串联排列的 SP6、T7 和 T3 启动子，这些载体特别适用于亚克隆转录模板。或者，Ambion 的无克隆启动子添加试剂盒 Lig'nScribe 可用于改变可 PCR 扩增

在哺乳动物细胞中进行RNA干扰:设计，实验和分析siRNA效应

, COS7, 293, NIH/3T3, A549, HT-29, CHO-KI, 和 MCF-7，选择同源序列部分最有效的siRNA，分别转染这8个细胞株。用Northern分析GAPDH和两个负对照(cyclophilin 和 28S rRNA)mRNA。结果显示，GAPDH siRNA对所有细胞株都表现出某种程度的基因沉默效果，说明基因沉默通路在多种哺乳动物细胞中是普遍存在的。 图二：不同哺乳动物细胞对siRNA诱导的基因沉默的易感性。 如图所示的细胞株分别用化学合成和体外转录

RNA探针合成方法和合成效率检测方法介绍

注意RNAse的防污染操作。 制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。 另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动