PI (Propidium Iodide) 碘化丙啶

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种常用的细胞核荧光染料，作为一种溴化乙锭（EB）的类似物，能够嵌入碱基之间实现与DNA结合。这种结合没有或者几乎无序列倾向性，大约每4-5个DNA碱基对结合一个染料。PI也能与RNA结合，需要用核酸酶处理来区分DNA和RNA染色。水溶液中PI的最大激发/发射波长是493/636nm。一旦与核酸结合，荧光信号明显增强20-30倍，最大激发波长向红色波段迁移~30-40nm，最大发射波长向蓝色波段迁移~15nm，从而使其最大激发/发射波长变为535/617nm。PI的摩尔吸光系数相对比较低，但是其具有足够大的斯托克司频移来同时检测核酸DNA和荧光标记抗体，只需要使恰当的滤片。PI适用于荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪以及荧光计分析。

PI不能穿透细胞膜而被排斥在活细胞外，但是可以穿过破损的细胞膜而对核染色。利用这一特性，通常与Calcein-AM、Hoechst 33258或 Hoechst 33342等活细胞荧光探针一起使用，同时对活细胞和死细胞染色和鉴定，用于细胞凋亡相关的研究。也可以用作多重荧光染色的复染剂，兼容于各种细胞标记技术，包括直接或者间接的荧光抗体检测，mRNA原位杂交，细胞结构特异性的荧光探针检测法以及组织染色。PI的单独染色也可以进行细胞周期的检测。

1. 储存液的配制
2. 1mg PI粉末（M. Wt= 668.4），用1ml去离子水充分溶解后配置成1mg/ml（1.5 mM）的储存液。4 ºC避光保存，至少6个月稳定。
   1. 贴壁细胞复染步骤（荧光显微镜检测）
3. 样本准备：根据自身样本选择合适的步骤固定细胞。PI染色一般在其它染色完成后再进行。PI复染要求细胞经透化处理。
4. RNase酶处理：若样本使用多 聚 甲 醛，甲醛或者戊 二 醛固定，则需要进行RNase处理。若样本用甲醇/醋酸或者丙 酮固定，通常不需要此步操作。a，于2×SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, pH 7.0)溶液平衡样本；b，将本品置于含有100µg/mL DNase-free RNase的2×SSC溶液中37°C孵育20min；c，用2×SSC溶液清洗样本3次，每次1min。
5. 复染：a，于2×SSC (0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, pH 7.0)溶液平衡样本；b，直接用2X SSC稀释1mg/ml（1.5 mM）PI储存液 1:3000，得到500 nM的PI工作液。通常添加300µL染液足够用于一个盖玻片细胞制片。染色1-5min。c，2×SSC清洗几次，流尽多余的缓冲液后，加入抗淬灭剂封片（比如Yeasen，货号：36308ES08）。d，选择荧光显微镜的合适滤片进行观察。
   1. 悬浮细胞复染步骤（流式细胞仪检测）
6. 样本准备：根据自身样本选择合适的步骤固定细胞。或者使用如下的步骤：
7. 收集一定量的细胞，密度约 2 × 10⁵ ~1 × 10⁶。离心收集细胞，吸掉上清液，用手轻弹管壁就剩下

• 将所有的重悬细胞转移到4ml于-20ºC预冷的无水乙醇，在高速涡旋混匀的同时一边用枪缓慢的添

• 离心收集细胞，除去乙醇。用手轻弹管壁以弹松细胞后，加入5ml室温的PBS。允许细胞水化15min；
• 复染
• 用染色液（100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂ , 0.5 mM MgCl₂ , 0.1% Nonidet^® P-40）稀

• 样本制备的最后一步后离心收集细胞，去除上清，用手轻弹管壁以弹松细胞后，加入1ml的PI染

1. 染色质FISH复染步骤
2. 样本准备：根据标准步骤制备样本。复染之前的最后一步用去离子水清洗样本以去除玻片上残留的缓冲盐。室温晾干。此步骤有助于减少非特异性的背景染色。
3. 复染
4. 工作液的配制：用PBS缓冲液直接稀释1 mg/ml（1.5 mM）的PI储存液1:1000，得到1.5 µM的