谷胱甘肽还原酶检测试剂盒

谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(Glutathione Reductase Assay Kit)是一种简单易行的通过紫外比色来检测细胞、组织或其它样品中谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)活性的试剂盒。谷胱甘肽还原酶在许多组织中都有分布，可以维持细胞内充足的还原型谷胱甘肽(GSH)水平。GSH可以清除自由基和一些有机过氧化物，或作为谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase)的底物来清除一些过氧化物。
谷胱甘肽还原酶可以还原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG，并可以通过测定A₄₁₂来检测TNB的生成量。适当设置应体系，前后两个反应合并起来后，GSSG/GSH过量而GR相对不足时，该反应体系中谷胱甘肽还原酶就成为整个反应体系的限速因素，此时黄色的TNB生成量和谷胱甘肽还原酶的活性呈线性正相关。从而通过测定A₄₁₂就可以计算出谷胱甘肽还原酶的活性水平。本试剂盒的具体反应原理如下：

两个反应相合并：
本试剂盒可以检测组织匀浆液上清、细胞裂解液上清等生物样品中的谷胱甘肽还原酶的活性。一个试剂盒共可以进行100次检测。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存，一年有效。NADPH溶解后宜-70℃保存，4℃可以保存一天，-20℃保存一周后NADPH会减少10%以上。GSSG和DTNB在配制成溶液后，适当分装，-20℃保存。
注意事项：
本试剂盒检测时牵涉到氧化还原反应，所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定。另外，硫酸钠、硫酸铵和都会干扰本试剂盒的测定。请尽量避免。
样品可以立即测定，也可以-70℃冻存待以后测定。
一定要严格控制反应时的温度，否则会引起较多误差。
NADPH不太稳定，要严格按照后续说明操作，谨防失活。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 
 

使用说明：
1. 样品的准备： 
a. 细胞样品的准备。可以用再康生物生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应的说明裂解细胞样品。
b.组织样品的准备。动物用含有1mM EDTA的生理盐水(0.9% NaCl)灌流清除血液后获取组织样品。可以用再康生物生产的Western及IP细胞裂解液参考相应的说明裂解组织样品。
c. 红细胞裂解液的准备。用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500微升全血4℃ 2500g离心5分钟。弃上清，沉淀用冰冷的生理盐水(0.9%氯化钠)洗涤3次。用约5倍细胞体积的冰冷的去离子水，例如Milli-Q纯水，重悬细胞沉淀，冰浴10分钟。4℃，8500g离心10分钟，取上清。
上述各种样品测定蛋白浓度后，推荐先尝试使用20-200微克蛋白测定谷胱甘肽还原酶的活性。如发现样品中谷胱甘肽还原酶的活力过高，可以用样品稀释液进行稀释。如样品中谷胱甘肽还原酶的活力过低，则需适当加大蛋白用量。
2. 试剂盒的准备工作：
a.配制6mM NADPH。在本试剂盒提供的5mg NADPH中加入1ml Milli-Q级纯水或重蒸水，溶解并混匀。预计多余的NADPH须立即分装，-70℃保存。
b. 在本试剂盒提供的14.2mg GSSG中加入10ml Milli-Q级纯水，溶解并混匀。预计多余的GSSG须立即分装，-20℃保存。
c.在本试剂盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本试剂盒提供的DMSO，溶解并混匀。预计多余的DTNB须立即分装，-20℃保存。
d. 所有试剂在使用前均须在水浴中或PCR仪等设备上温育到25℃。
3. 样品测定：
a. 参考下表，使用96孔板，依次加入各溶液，混匀。

b.加入6.6微升DTNB溶液，混匀。
c.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A₄₁₂。如果仪器可以设置温度，把温度设置在25℃，否则可以通过空调调节室温到25℃，待预计仪器也达到25℃后再开始测定A₄₁₂。
d.每隔2分钟记录A₄₁₂值，至少连续记录10分钟，获得5个点的数据。或者如果仪器具备相应功能，可以让仪器连续测定10分钟或自动每隔2分钟测定一次A₄₁₂。如果样品的吸光度比较低，可以延长孵育时间，样品的吸光度在一定范围内会随时间的延长接近于线性增加的，此时可以考虑每10分钟测定一次吸光度。
e.计算时每个样品的A₄₁₂/min都需要扣除相应的样品本底对照测定出来的A₄₁₂/min。肝脏裂解样品的实测效果参考图1。
图1. 肝脏裂解样品实测效果图。4.样品中谷胱甘肽还原酶酶活力的计算：
a.为了精确测定谷胱甘肽还原酶的活性，A₄₁₂每分钟的变化幅度宜在0.005-0.1/分钟。即相当于样品测定时的最终活力单位宜在0.8-10mU/ml。如果酶活力过高可以用样品稀释液进行适当稀释，如果酶活力过低，可以设法加大样品的用量。
b.谷胱甘肽还原酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1 unit)在25℃，pH7.5的条件下，在1分钟内可以还原化1微摩尔GSSG。1 U=1000 mU。TNB的摩尔消光系数为14.15M^-1cm^-1。
c.对于谷胱甘肽还原酶：1mU/ml＝1nmol TNB/min/ml＝(A₄₁₂/min)/0.01415
即相当于：[检测体系中谷胱甘肽还原酶活力]=[A₄₁₂/min(sapmle)－A₄₁₂/min(blank)]/0.01415
注：[检测体系中谷胱甘肽还原酶活力]的单位为mU/ml。
d.[样品中谷胱甘肽还原酶活力]＝[检测体系中消耗谷胱甘肽还原酶活力] X[稀释倍数]/[样品中的蛋白浓度]
[样品中谷胱甘肽还原酶活力]的单位为：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；
[样品中的蛋白浓度]的单位为：mg/ml。
e.计算示例：样品的蛋白浓度经测定为5mg/ml，用样品稀释液稀释10倍后，取10微升稀释后的样品参考表1进行测定。如果A₄₁₂/min(sapmle)＝0.048，A₄₁₂/min(blank)＝0.006，那么
[检测体系中谷胱甘肽还原酶活力]= (0.048-0.006)/0.01415=3.0mU/ml
[样品中谷胱甘肽还原酶活力]= 3.0mU/mlX10X20/(5mg/ml)=0.12U/mg(蛋白)