TEV Protease

TEV Protease是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase (GST)、His或者其它标签的蛋白酶。
建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端，并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后，在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基，从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。构建含有TEV Protease专一性识别位点的目的蛋白表达质粒，可以考虑选购再康生物的质粒pET-N-His-TEV (P2905)。
TEV Protease的最佳酶切温度是30℃，在29-34℃范围内均具有较高的酶活性，但当温度达到或高于高37℃时，其酶活性会急剧下降。在实际操作过程中，为尽量保留目的蛋白的结构和生物活性，建议在4℃用TEV Protease酶切过夜。TEV Protease在pH6.0-9.0范围内具有活性，而当pH小于或等于5时，会失去酶活性。
TEV Protease还有一个突出的优点是在400mM咪唑中仍有较高活力，因此对于很多用鎳柱纯化的His标签目的蛋白，可直接将TEV Protease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中，在4℃边透析去除咪唑边进行酶切。当然也可以在透析后再用TEV Protease进行酶切以去除His标签。经过酶切的目的蛋白，溶液中带有His标签的本TEV Protease以及切除下来的His标签，都可以通过与镍柱结合而去除。His标签蛋白的纯化可以考虑选购再康生物的BeyoGold™ His-tag Purification Resin 
(P2210/P2218/P2220)或His标签蛋白纯化试剂盒(P2226)。
TEV Protease的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhiibtor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等，可以显著抑制TEV Protease的酶活力，因为天然的TEV Protease含有其维持酶活力所必需的Cys151。
酶活性单位定义：30℃，pH8.0条件下反应1小时，能够切割3µg对照底物达85%以上所需的酶量为一个活性单位。
再康生物TEV Protease酶活性鉴定结果可参考图1。

图1.TEV Protease切割GST标签蛋白的效果图。含有TEV Protease识别位点的76kD GST标签蛋白与TEV Protease进行反应，
底物的用量为3μg，酶的用量依次为0、0.1、0.25、0.5、0.67、1、2U，30°C在1X TEV Buffer中反应1小时后取样进行
SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。酶切产物大小为约50kD的目的蛋白和约26kD的GST标签。

TEV Protease分子量大小约28kDa，纯度：≥95%。
TEV Protease储存液组成为：25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 50%(v/v)甘油, pH8.0。
10X TEV Buffer组成为：500mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM DTT, pH8.0。
本产品一个包装含有1000单位的酶，可用于约3mg带有TEV Protease识别位点的融合蛋白的切割。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
 

使用说明：
1.由于不同标签蛋白具有不同的特性，所以在实际使用时，建议对酶和标签蛋白的比例进行适当优化，以下是一个简单的估计酶用量的实验方案。
a.按照下表设置酶切反应体系：

注：如果标签蛋白浓度为2μg/μl，那么Y=8/2=4，即须使用4μl 2μg/μl的标签蛋白。
b.将反应混合物放置于30℃反应1、2、4或6小时。如果目的蛋白在30℃很不稳定，可以考虑4℃反应过夜(16小时左右)。正常情况下按照上述反应体系，无论30℃反应1小时还是4℃反应16小时实际测定发现都可以充分剪切并去除标签的。
c.取20μl样品进行SDS-PAGE电泳分析，确定反应所需的合适酶量和合适的反应时间。