Human CRP ELISA Kit

再康生物的Human CRP ELISA Kit (Human C-Reactive Protein Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人C反应蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的CRP的ELISA试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。多次重复检测结果表明，最小检出量为1.4ng/ml。板内、板间变异系数均小于10%。如需进行更高灵敏度的检测，可选用Human CRP ELISA Kit (Ultrasensitive) (PC198)，该试剂盒最小检出量为14.8pg/ml。
C反应蛋白(C-Reactive Protein, CRP)，又叫正五聚蛋白1(Pentraxin 1)，是一种非糖基化蛋白，属于正五聚蛋白家族，该家族中还包括正五聚蛋白2/SAP和正五聚蛋白3/TSG-14。CRP的主要功能是作为先天性免疫反应的传感器和活化剂。在人体内，CRP是一种主要的急性时相蛋白，其循环浓度在炎症初始时会显著升高。然而在小鼠体内，血浆CRP水平在炎症发生期间仅出现轻微上升，正五聚蛋白2则具有与CRP在人体内相类似的浓度变化。CRP蛋白通过非共价键自组装形成分子量在110-120kDa之间的五聚体，成熟的人CRP与小鼠CRP和大鼠CRP分别具有71%和64%的氨基酸同源性。
CRP能够与凋亡的细胞及细菌结合并促进其被吞噬细胞吞噬，CRP还能与补体级联系统中的一些蛋白如C1q、C4BP和Factor H结合，增强经典补体激活途径的活化，并增加C3b蛋白的沉积，在之后的应答过程中，CRP能够通过与C4BP和Factor H结合抑制补体调节细胞的溶解。这些作用能够诱导补体抑制蛋白CD46、CD59和CD55/DAF的表达，抑制膜攻击复合物(Membrane Attack Complex, MAC)的合成。
CRP与巨噬细胞和树突状细胞表面的Fcγ RIA和Fcγ RIIB结合使得CRP连接的靶细胞被细胞吞噬清除，Fc受体也是这一过程的必不可少的受体之一。CRP与Fcγ RⅠ结合，诱导Src活化，并抑制炎症反应。另外CRP还能够促进树突状细胞成熟，增强体液免疫。但在心血管疾病当中，CRP能够与被氧化的低密度脂蛋白结合，加剧冠状动脉梗塞部位的组织损伤，抑制受损血管内皮的修复。
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法(Sandwich ELISA)检测样品中人CRP的浓度，其原理见图1。人CRP特异的单克隆捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标准品或样品时，其中的人CRP会与捕获抗体结合。当加入辣根过氧化物酶标记人CRP抗体后，辣根过氧化物酶标记人CRP抗体与人CRP结合，形成夹心的免疫复合物。最后加入显色剂TMB溶液，固相捕获的辣根过氧化物酶就会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。人CRP浓度与A450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中人CRP浓度。

图1. 双抗体夹心ELISA原理图。

一个包装的本试剂盒，包括标准品检测，可以进行96次检测。
包装清单：

保存条件：
标准品4℃保存，1-2周内有效，-20℃保存6个月内有效；试剂盒其它组分4℃保存6个月内有效。除标准品外，试剂盒其它组分严禁冻存。
注意事项：
由于标准品一般是冻干粉，在制备后需要严格校准，所以标准品的瓶数及每瓶标准品所需加入的稀释液体积请以实际收到的试剂盒及标准品标签上的标注为准。
洗涤液(20X)在低温下可能有结晶，如果发现有结晶，请室温水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
为保证标准品的精确性，标准品配制使用后，如果有剩余请勿再次使用。
TMB溶液请勿接触氧化剂和金属，否则容易失效。
加样时，请注意每个样品或标准品必须更换枪头，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取体积的误差。
由于本试剂盒均经过独立测试，所以请勿混用不同货号和不同批次的试剂盒组分，即使是同种试剂盒不同批次的试剂盒组分也不能混用。多个试剂盒同时检测时，请独立使用各个试剂盒中的试剂，请勿使用不同试剂盒中相同名称的组分。
充分混匀对保证反应结果的精准性很重要，在加液后请轻轻晃动整个96孔板，以保证混匀。
本试剂盒很多操作在室温进行，要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致最终检测到的吸光度显著下降。
洗涤过程非常重要，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
检测标准品和样品时建议设置重复孔，以确保检测结果的可信度。
加样过程中须避免气泡的产生。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
 

使用说明：
1.样品准备
a. 样品的准备请按下列流程进行操作：
(a)细胞上清样品离心取上清即可(如100-500g，5分钟)。
(b)对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。
(c)对于血浆样品，采集的全血建议使用EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。
(d)若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。
b.血清样品不应添加任何防腐剂或抗凝剂。
c.样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。
d.请勿使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
注：血清或血浆样品可能需要用1X标准品稀释液倍比稀释后再检测。
2.检测前准备工作
a.试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
b.配制适当量的标准品稀释液：将标准品稀释液(5X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml标准品稀释液(5X)加40ml水混匀后即为1X的标准品稀释液。
c.配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。
d.按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到5000pg/ml。通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要使用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。
e.取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液，并参考图2进行标准品的倍比稀释，最终得到5000、2500、1250、625、312.5、156.25pg/ml共六个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共七个标准品浓度。

图2. 标准品倍比稀释示意图。按标准品(STANDARD)标签上标注体积加入标准品稀释液溶解并混匀后的浓度为标准品的起始浓度。其它的倍比稀释后的浓度依次为起始浓度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。

3.洗涤方法
自动洗板机或手工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。
4.实验过程需自备的材料和仪器
a.不同规格的移液枪及相应的吸头
b.酶标仪
c.自动洗板机(如果没有也可以手工洗板)
d.去离子水或双蒸水
5.操作步骤
a.计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保 存于4ºC。
b.每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和 终止液。
c.分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中。用封板膜(透明)封住反应孔，室温(25-28ºC)孵育30分钟。血 清或血浆样品的CRP的检测，不同样品稀释比例有所区别，一般范围在1000-20000倍，如无明确范围，建议从1000倍开 始稀释，如果样品浓度过高，超过检测范围，请加大稀释倍数后重新稀释检测。请注意记录好样品的稀释倍数。
注意：请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或最低标准品 浓度，请适当稀释或浓缩后再进行检测。
d.洗板3次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
e.按照100μl/孔立刻加入辣根过氧化物酶标记人CRP抗体。用封板膜(透明)封住反应孔，室温(25-28ºC)孵育30分钟。
f.洗板3次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
g.按照100μl/孔加入显色剂TMB溶液，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育15-20分钟。室温偏低时需要适当延长孵 育时间，此时可以孵育至标准品出现非常显著的颜色变化，若样品浓度足够高也会出现显著的颜色变化。
h.按照50μl/孔加入终止液，混匀后立即测量A450值。
6.结果分析
a.复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
b.每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。
c.绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。

 
图3. Human CRP ELISA Kit的标准曲线。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

d.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。