RNAeasy™动物小RNA抽提试剂盒(离心柱式)

再康生物的离心柱式RNAeasy™小RNA抽提试剂盒(RNAeasy™ Small RNA Isolation Kit with Spin Column)，也称离心柱式miRNA抽提试剂盒(miRNA Isolation Kit with Spin Column)，是一种基于离心柱法从动物组织或培养的动物细胞中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地抽提miRNA等小于200个核苷酸(nucleotide, nt)的小RNA(small RNA)的试剂盒。
本试剂盒抽提得到的小RNA可用于反转录、RT-PCR、qPCR、Northern等常规实验，也可以用于基因芯片分析
(microarray)、高通量测序(high throughput sequencing)等对小RNA质量要求较高的情况。
再康生物的三款离心柱式及Trizol法RNA抽提试剂盒的主要特点和差异如下：

动物组织或细胞中的RNA按照长度可以分为长链RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，长链RNA通常大于200nt(也常被称为总RNA)，而小RNA通常小于200nt。长链RNA按照是否编码蛋白或多肽可以分为长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非编码的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
本试剂盒抽提小RNA的基本流程如图1所示。样品在裂解液中迅速裂解，释放出总RNA，然后在两次高速离心过程中，通过离心柱将不同大小的RNA分离。第一次过柱时，200nt以上的RNA特异性结合到纯化柱上，而200nt以下的小RNA穿柱而过被收集到液体收集管中；第二次过柱时，特定的结合体系使小RNA结合到另一个纯化柱上。然后通过2次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质，最后用洗脱液将高纯度的小RNA洗脱下来。

图1. 离心柱式小RNA抽提流程示意图

本试剂盒使用安全。本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行小RNA分离纯化，不仅能有效避免传统的Trizol法抽提时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂，也能有效避免如国外知名的Q品牌等公司使用类似于Trizol的裂解液裂解样品、接着使用氯仿分层、后续再进行柱纯化等涉及的有毒有害有机试剂。
本试剂盒使用快速、便捷。本试剂盒采用柱纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，抽提操作过程仅20-25分钟。相比于传统的Trizol抽提法，本试剂盒能够有效去除大分子RNA，操作流程显著简化，缩短了抽提时间，降低了RNA降解的风险。和国外同类柱纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。
本试剂盒抽提获得的小分子量RNA得率高、纯度好。100万培养动物细胞约能抽提得到1-2μg小RNA，5mg小鼠肝脏组织约能抽提得到1-1.5μg小RNA。A260/A280通常为2.0-2.2。本试剂盒与国际知名T品牌同类产品的抽提效果对比图参见
      本试剂盒与T品牌同类产品的小RNA抽提效果对比。样品为冻存的100万个HeLa细胞、5mg小鼠肝组织和5mg小鼠肾组织。洗脱液用量均为30μl。均取6μl洗脱的样品经变性处理后，在含7M尿素的15% TBE-PAGE中电泳约90分钟后在NA-Red溶液中染色后拍照。再康生物试剂盒抽提产物的A260/A280依次为2.01、2.07和2.06；T品牌试剂盒抽提产物的A260/A280依次为1.93、1.79和1.29。实际抽提效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒用于抽提18-200 nt小RNA，主要包括5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、microRNA (miRNA)，以及short
interfering RNA (siRNA)、piRNA、tsRNA等，能够有效去除基因组DNA和200nt以上的RNA，如28S rRNA、18S rRNA、mRNA等。
本试剂盒适用于新鲜或冻存的动物组织或细胞样品小RNA的抽提。样品的用量对抽提效果影响较大，样品用量过多会导致在第一次过柱时不能最 大 程 度去除200nt以上的RNA，通常建议培养细胞的用量不超过100万，动物组织的用量不超过5mg。
本试剂盒可用于50个样品的小RNA抽提。
包装清单：

保存条件：
      室温保存，一年有效。
注意事项：
      对于富含RNase的样品(如动物组织)，建议使用前在裂解液中添加二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)至终浓度为40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巯基乙醇至终浓度为1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巯基乙醇)，含DTT或β-巯基乙醇的裂解液可在室温放置1个月。
      本试剂盒提供的所有试剂和耗材都是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
      对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用再康生物生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
      使用冻存的细胞或组织抽提小RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品中的RNA。对于组织样品，推荐使用再康生物生产的RNALater™动物组织RNA稳定保存液(R0118)进行保存以保证样品RNA的完整性。 
      本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。 
      废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。 
      结合液I、结合液II和洗涤液中含有乙醇，使用后须旋紧瓶盖以防挥发，并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。 
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1.实验材料的准备。
细胞样品：收集50-100万左右的细胞。对于悬浮细胞，1000-2000g离心1分钟后弃上清，加入300μl裂解液，轻轻吹打8-10次至固悬物溶解、溶液澄清；对于贴壁细胞，吸净培养液后加入300μl裂解液，轻轻吹打5-10次至固悬物溶解、溶液澄清，转移至一洁净离心管内。
组织样品：取5mg动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入300μl裂解液。也可将组织置于1.5ml离心管中，迅速加入300μl裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后，轻轻吹打匀浆液8-10次，室温放置3-5分钟。然后约14,000g离心2分钟，将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
注意：细胞的数量不超过100万，动物组织的用量不超过5mg，细胞或组织用量过多会导致大分子RNA不能去除完全。对于富含RNase的样品，裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
2.加入300μl结合液I至裂解液中，轻轻颠倒混匀3-5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。
3. 将混合物(包括沉淀物)转移至第1个纯化柱内，12,000g离心30秒，回收收集管内液体至一新的1.5ml离心管。 
注意：对于一些非常特殊的样品，如出现溶液未完全通过时，可延长离心时间至1-2分钟，或者加大离心力至16,000g。对于一些能快速启动达到12,000g的离心机，离心30秒已经足够，对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。
4.向溶液中加入700μl结合液II，混匀后，将混合物(包括沉淀物)分两次转移至第2个纯化柱内，每次12,000g离心30秒后倒弃收集管内液体。
注意：加入结合液II后溶液总体积超过纯化柱的容量(约750μl)，因此须分成2次过柱，即将一半的混合物(约650μl)加入纯化柱内后12000g离心30秒，倒弃收集管内液体，再将剩余的混合物加入纯化柱内12000g离心30秒，并倒弃收集管内液体。
5.加入600μl洗涤液，12,000g离心30秒，倒弃收集管内液体。
6.重复步骤5一次。
7.最高速(约14,000-16,000g)离心2分钟，去除残留液体。
8.将RNA纯化柱置于一新的1.5ml离心管上，加入30-50μl洗脱液，室温放置2-3分钟，最高速离心30秒，所得溶液即为纯化的小RNA。 
注意：洗脱液需要加到纯化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20ul，但洗脱下来的总RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量10-35%的小RNA。