DpnI

DpnI

DpnI内切酶为再康生物最 新研发产品，基本信息如下：

甲基化干扰？

识别序列	缓冲液兼容性(%)						酶切温度	失活条件
GA* ^TC CT ^A*G	1X B	1X G	1X O	1X R	1X Y	2X Y	37℃	80℃  20min	甲基化的序列 才可被酶切
	100	100	50-100	50-100	100	50-100

*，该位点甲基化后才可以被DpnI所识别并酶切。
DpnI识别并酶切DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化(N6-methyladenine)的GATC序列。DpnI识别位点中两个腺嘌呤的N6位都甲基化时，呈现正常的酶活力；只有一个腺嘌呤的N6位甲基化时，酶切活力会降低约60倍。
从dam⁺(Dam甲基化酶表达阳性)大肠杆菌菌株如DH5α等提取的质粒的GATC序列中腺嘌呤N6位被甲基化，从而可以被DpnI识别和酶切；而从dam^-(Dam甲基化酶表达阴性)大肠杆菌菌株如JM110等提取的质粒的GATC序列中腺嘌呤N6位没有被甲基化，从而不能被DpnI识别和酶切(参考图1)。

图1.DpnI酶活性检测结果图。A.分别用从JM110菌株(dam^-)和DH5α菌株(dam⁺)中提取的质粒400ng，在20μl酶切体系中，分别加入或不加入10U的DpnI，37℃酶切1小时，然后电泳分析。图中可见从DH5α中提取得到的甲基化质粒可以被DpnI完全消化，而对于从JM110中提取得到的非甲基化质粒没有任何非特异性的酶切作用。B.取图A中各酶切产物5μl分别转化DH5α感受态细胞然后涂板，培养过夜。图中可见从DH5α中提取得到的甲基化质粒被DpnI消化1小时后，不会产生任何克隆，进一步验证了DpnI在1小时内可以完全消化甲基化的质粒，并确保本产品可以用于质粒点突变。

酶储存液组成为：10mM Tris-HCl (pH7.4 at 25℃)，300mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/ml BSA and 50% glycerol。
1X Buffer Y组成为：33mM Tris-acetate (pH7.9 at 37℃)，10mM magnesium acetate，66mM potassium acetate，0.1mg/ml BSA。
酶切和连接效率：50倍过量的本内切酶消化1小时，>70%被酶切的pBR322 DNA片段可以重新连接，这些片段>95％可以被重新酶切(recut)。
活性单位定义：在37℃，50微升反应体系中反应1小时，将1微克的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位，即1U。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
ZK-6257-1	DpnI(10U/μl)	500U
ZK-6010Y	10X Buffer Y	1ml
－	说 明 书	1份

 

保存条件：
-20℃保存。
注意事项： 
内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
如果发现预期的酶切位点不能切开，请确认特定位点是否已经被甲基化。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 单酶切时可以参考如下反应体系进行：

待酶切DNA	不超过1μg
双蒸水或Milli-Q水	适量
10X Buffer Y	2μl
DpnI	0.5-1μl
总体积	20μl
37℃孵育1小时或更长时间

说明：请注意把Buffer和水等充分混匀后再加入内切酶，加入内切酶后可以用枪吹打或轻轻Vortex混匀。通常参考上述条件孵育1小时已经足够，但多孵育数小时甚至孵育过夜也不会产生负面影响。如果酶切较长时间甚至酶切过夜，可以使用更少量的酶。待酶切DNA量较大时，可以适当延长酶切时间或按比例放大酶切体系。
2. 双酶切或多酶切时，需选择适当的可以兼容两个或多个内切酶的缓冲液，然后参考上表设置反应体系。如果没有合适的缓冲液可以选择，可以在一种酶消化完毕后进行纯化，纯化完毕后再进行另外一种酶切反应。