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联硕生物
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文献和实验Elabscience|巨噬细胞极化总失败?RAW264.7/THP-1/BMDM/hMDM四大模型避坑指南与实操全攻略
抗人 CD68 抗体 [Y1/82A] E-AB-F1298J PerCP/Cyanine5.5 标记抗人/猴 CD163 抗体 [GHI/61] 三、小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)极化流程及表面标志物检测方案 1. BMDM极化培养及流式检测流程 BMDM的分离与培养: (1)处死小鼠后,将小鼠置于75%乙醇中浸泡5 min进行灭菌消毒。 (2)完整取出其双侧股骨和胫骨,剔除骨上附着的肌肉和组织。 (3)将清洗好的股骨、胫骨分开,并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断,使用注射器吸取
的 ULTRAhyb-Oligo 缓冲液(17x 缓冲液)。使用前需在 68℃ 环境中进行溶解。 ( 7 ) 用 0.5 U T4 多核苷酸激酶(PNK,Roche) 和 6 μl [γ-32P ] ATP ( 5000 Ci/mmol ) 标记 1 μmol/L DNA 寡核苷酸(约含有 10 个与目的基因互补的 DNA 寡核苷酸)。 ( 8 ) 参照 Hamilton 和 Baulcombe 的方法,在 35°C 条件下进行 RNA 印迹杂交[14]。 3. 注释 注
影响不大,不相同的碱基最好不要在两端,因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T,而不能为G或A,因为A、T为双键,而G、A为三键。 2. 探针长度:Taqman探针的长度最好在25-32bp之间,且Tm值在68-72℃之间,最好为70℃,确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段,保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针,在TAMER之后再标记一个MGB,可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短
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