测序用 GeneRacer™ 试剂盒（含 SuperScri

GeneRacer™ 试剂盒提供了一种使用来自表达序列标签 (EST)、消减 cDNA、差异显示或文库筛选的已知 cDNA 序列获得 cDNA 全长 5' 和 3' 末端的方法。该试剂盒通过在扩增过程中消除截短信息确保仅扩增全长转录本。使用测序用 Zero Blunt™ TOPO™ PCR 克隆试剂盒（平末端 PCR 产物）或测序用 TOPO TA Cloning™ 试剂盒（3' A 突出端 PCR 产物）可快速轻松地克隆 RACE PCR 产物。使用提供的方案，可使用 1 µg 总 RNA 扩增稀有（30 个拷贝/细胞）和长 (9 kb) 转录本的 cDNA 末端并对该末端进行测序。使用 GeneRacer™ 试剂盒，您可以：

•由长度至少 10 kb 的转录本生成 cDNA
• 获得稀有转录本（少于 30 个拷贝/细胞）的全长 5´ 末端
• 克隆全长 5´ 和 3´ 末端以构建完整 cDNA 序列SuperScript™ III RT
GeneRacer™ 试剂盒包含 SuperScript™ III 逆转录酶 (RT)，用于改进来自长且复杂 mRNA 的全长 5´ 末端扩增。SuperScript™ III RT 的 RNase H 部分已发生突变，可避免在 cDNA 合成期间切割 mRNA。这样可增加 cDNA 的大小和得率。SuperScript™ III RT 比野生型 RT 更耐热。可以在较高温度下进行逆转录，解开复杂模板的二级结构，并能够完成 cDNA 合成。GeneRacer™ 试剂盒的工作原理
GeneRacer™ 试剂盒确保仅扩增包含全长 cDNA 末端的转录本（如图所示）。高级方案从 RNA 水平开始，仅专门靶向 5´ 加帽 mRNA。在后续步骤中，移除帽并用 GeneRacer™ RNA 寡核苷酸替换。在逆转录过程中，GeneRacer™ RNA 寡核苷酸序列被整合到 cDNA 中。只有完全逆转录的 cDNA 将包含该已知序列。然后使用 GeneRacer™ RNA 寡核苷酸序列特异性 GeneRacer™ 5´ 引物和基因特异性引物进行 5´ RACE PCR。得到含有全长 5´ cDNA 序列的扩增 DNA。灵敏度和长度
为证明 GeneRacer™ 试剂盒捕获全长 5´ cDNA 末端的能力，扩增了转录起始位点已知的基因的 5´ 末端。