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- 2025年09月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
148
- 英文名：
Diagnostic Kit for Listeria monocytogenes DNA
- 保质期：
1年
- 供应商：
上海晅科生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
- 规格：
50T
英文名称：Diagnostic Kit for Listeria monocytogenes DNA
本试剂盒适用于检测水样粪便，疑似污染的水、食物等样本中的单增李斯特菌，用于单增李斯特菌感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对单增李斯特菌特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光 PCR 技术对单增李斯特菌的核酸进行体外扩增检测，用于对可疑感染病料的病原学检测。
单增李斯特菌（LM）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：
| 包装规格 | 50T/盒 |
| LM 反应液 | 500μL×2 管 |
| 酶液 | 50μL×1 管 |
| LM 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
| 阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
标本采集：水样便取 0.5~1mL；疑似污染的食物取 1g
保存和运输：采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。
使用方法：
1. 样品处理（样本处理区） 1.1 样本前处理 水样便 13000rpm 离心 2min，去尽上清；疑似污染的食物用手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；疑似污染的水直接取 100μL 1.2 核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取试剂（离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂 说明书进行操作。
2. 试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 试剂 LM 反应液 酶液 用量（样本数为 N） 19μL 1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3. 加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区） 4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内； 4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM，淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。 4.3 推荐循环参数设置： 步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号 1 1 cycle 95℃ 2min 否 2 45cycles 95℃ 15sec 否 60℃ 30sec 是
5. 结果分析判定 5.1 结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。 5.2 结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。 5.3 质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。 6. 检测方法的局限性 1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关； 2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果； 3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果； 4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果； 5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果； 6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果； 7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
注意事项
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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文献和实验序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出PCR 产物中杂合的单碱基突变 这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400 bp 或者更小时，灵敏性最高。除了能鉴定出未知的杂合突变，高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变
光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。 主要有以下优点： 1、探针特异性强，假阳性率低； 2、操作快速，不需要PCR后处理； 3、定量范围宽，HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane′s particle/ml)； 4、闭管操作，PCR产物污染少； 5、灵敏度高。 主要方法有： 1、荧光探针法：进行荧光PCR检测时，要求荧光探针必须完全与靶基因互补，长度以20-30个碱基为宜，必要时3′端磷酸化封闭，以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用Taq
，平均批间变异系数为11.4％；液相芯片与ELISA法检测结果的相关系数R2为0.88～0.99。 国外多家公司已推出了商品化的细胞因子液相芯片检测试剂盒，比如R&D 公司的Flurokine MAP系列、Linco Research公司的LINCOplex 试剂盒、BioSource公司的Antibody Bead Kit、Bio Rad公司的Bio Plex系列等，可用于来自人、小鼠、大鼠的样品，既有一次检测单种细胞因子的试剂盒，也有预先混合多种细胞因子抗体交联微球而一次检测多个指标
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