对虾肝肠孢子虫(EHP)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

对虾肝肠孢子虫(EHP)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Enterocytozoon hepatopenaei Detection Kit
虾肝肠孢虫病(Enterocytozoon hepatopenaei disease )，也称作肝胰腺微胞子虫病（Hepatopancreatic microsporidiosis，HPM），由肝肠孢子虫感染对虾所引发。患病对虾肝胰腺和肠道颜色较深，严重者肝胰腺萎缩，生长缓慢，个体明显偏小，感染群体生长差异明显增大。在正常养殖条件下，摄食正常，肠胃充满食物，不出现大量、急性死亡。 本试剂盒适用于检测本对虾不同组织样本中的虾肝肠孢子虫病毒，用于虾肝肠孢子虫感染的辅助诊断。

本试剂盒对虾肝肠孢子虫基因保守区设计特异性的引物和探针，用荧光 PCR 技术对虾肝肠孢子虫的核酸进行体外扩增检测，用于对可疑感染病料的病原学检测。

对虾肝肠孢子虫(EHP)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：

包装规格	25T/盒	50T/盒
EHP 反应液	500μL×1 管	500μL×2 管
酶液	25μL×1 管	50μL×1 管
EHP 阳性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

标本采集：对虾受精卵、幼体、仔虾取完整个体；幼虾至成虾阶段取去除眼柄的头胸部(肝胰腺、鳃丝、心脏等)、肠组   织或粪便。受精卵、幼体、仔虾或达到 0.5 g 样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检验。所取样品分别置于 1.5 mL 离心管中，立即进行 DNA 提取操作或于-20℃暂时保存。

保存和运输：采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

使用方法：
1.    样品处理（样本处理区） 1.1    样本前处理 取 0.5g 样品于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。 1.2    核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请   按照试剂说明书进行操作。 2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 试剂    EHP 反应液    酶液 用量（样本数为 N）    19μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。 3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。 4.    PCR 扩增（核酸扩增区）   4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内； 4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL； 荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。 4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    95℃    2min    否 2    45 cycles    95℃    15sec    否         60℃    30sec    是 5.    结果分析判定 5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。 5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线； 可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40
注意事项
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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