猪圆环病毒 4 型(PCV-4)核酸检测试剂盒（探针法荧光P

猪圆环病毒 4 型(PCV-4)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
英文名称：Porcine circovirus type 4 Detection Kit 
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）为无囊膜单股负链环状 DNA 病毒，根据其抗原性和基因组特性分为4 种基因型。猪圆环病毒 4 型（PCV4）是 2019 年在我国湖南省患有严重临床疾病的猪群中首次发现的一种新型PCV，随后国内多个研究团队调查到国内各省份均存在 PCV4 的流行。PCV4 可以单独感染，又可与多种病毒混合感染任何年龄段的猪，其感染后可以导致宿主各器官组织，如肺、肝、淋巴结等产生明显病变，但其临床表征不明显，大部分为健康状态的亚临床状态。 本试剂盒适用于检测病死猪（包括流产的死胎）或扑杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏）、 血清等样本中的猪圆环病毒 4 型感染的辅助诊断。

本试剂盒根据猪圆环病毒 4 型基因的高度保守区域设计的特异性引物和荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪圆环病毒 4 型 DNA 进行体外扩增检测，用于对可疑感染病料的病原学检测。

猪圆环病毒 4 型(PCV-4)核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）试剂组成：

包装规格	25T/盒	50T/盒
PCV-4 反应液	500μL×1 管	500μL×2 管
酶液	25μL×1 管	50μL×1 管
PCV-4 阳性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用

储存条件及有效期：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

适用仪器：ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

标本采集：组织样品采集：采取病死猪（包括流产的死胎）或扑杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏）   装入灭菌 15 mL 离心管中，编号，送实验室。血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于 5 ml，置 于无菌离心管内，室温或者 37℃倾斜放置自然凝集 20 min ~30 min，2 000 r/min~3 000 r/min 离心 10 min，吸取上清液到新的离心管内备用。精液样品采集：按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。粪便样品采集：取猪新鲜粪便 1g，装入 15mI 灭菌离心管中，加入 5mL PBS，混匀。细胞培养物：细胞培养物反复冻融 3 次，第 3 次解冻后，将细胞培养物置于 1.5 mL 无 DNA 酶的灭菌离心管内，编号备用。

保存和运输：采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

使用方法：
1.    样品处理（样本处理区） 1.1    样本前处理 组织样品：取 1g 解冻的组织，剪碎，加入 2 mL PBS 进行研磨，制备组织匀浆，8000 r/min 离心 5 min，取上清用于后续的核酸提取。血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。粪便样品：3000 r/min 离心10 min，取上清液，转入 1.5 mL 离心管中，用于后续的核酸提取。细胞培养物：4000 r/min，4℃离心 l0 min， 取上清用于后续的核酸提取。 1.2    核酸提取 推荐采用公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取， 请按照试剂说明书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：   试剂    PCV-4 反应液    酶液 用量    19μL    1μL 将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（ReporterDye）FAM，淬灭通道 （QuencherDye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置： 步骤    循环数    温度    时间    收集荧光信号 1    1 cycle    95℃    2min    否 2    45 cycles    95℃    15sec    否         60℃    30sec    是 5.    结果分析判定 5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果无 Ct 值，且无特异性扩增曲线； 可疑：样本检测结果 40＜Ct 值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为 40 5.3    质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6.    检测方法的局限性 1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关； 2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果； 3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果； 4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果； 5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果； 6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果； 7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

注意事项 
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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