Cytiva Ficoll-Paque PREMIUM 密度

一、产品概述
Ficoll-Paque PREMIUM 是一种无菌、即用型密度梯度离心介质，基于Ficoll®-甲泛影酸钠（sodium metrizoate）的无菌溶液，密度精确控制在1.077±0.001 g/mL（20℃）。该产品专为从人外周血、骨髓及其他生物样本中分离单核细胞（如淋巴细胞、单核细胞）而设计，通过密度梯度离心法实现高效、高纯度的细胞分离，广泛应用于免疫学、细胞生物学及分子生物学研究。

二、产品特征
• 根据ISO 13485认证的质量管理体系生产
• 适合体外应用
• 无菌即用试剂
• 确保内毒素水平低(< 0.12 EU/mL)并经过测试

三、产品优势
高分离效率：精确的密度梯度确保单核细胞与红细胞、粒细胞等杂质高效分离，目标细胞回收率高（通常>80%）。
细胞活性保护：低渗透压（285±15 mOsm/kg H₂O）及优化的pH值（6.8~7.4）设计，大大减少离心过程中细胞损伤，维持细胞活性与功能完整性。
无菌即用型：产品经0.22μm滤膜无菌过滤，无需预处理，直接使用，降低实验误差与操作时间。
批次一致性：严格的生产质控确保不同批次间密度、渗透压等关键参数高度一致，实验结果可重复性强。
低内毒素水平：内毒素含量≤0.12 EU/mL，符合细胞培养级标准，避免对细胞活化或后续实验（如流式分析、细胞培养）产生干扰。

四、产品规格（Ficoll-Paque PREMIUM 6x100mL）

五、适用范围
样本类型：人外周血、脐带血、骨髓、脾脏等组织单细胞悬液。
分离目标：外周血单个核细胞（PBMCs），包括淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）、单核细胞等。
应用场景：细胞分离纯化、细胞表型分析、细胞培养、病毒分离、核酸提取、流式细胞术、细胞治疗研究等。

六、储存条件
储存温度：4~30℃避光保存
保质期：未开封状态下，3年（具体以产品标签为准）
注意事项：避免冷冻或剧烈震荡，开封后建议尽快使用，剩余液体需无菌操作分装并在2~8℃保存，2周内使用完毕。

七、使用方法（简要流程）
样本预处理：将抗凝血样本（如EDTA或肝素抗凝外周血）与等量平衡液（如PBS或生理盐水）稀释，充分混匀。
梯度制备：取15mL离心管，缓慢加入Ficoll-Paque PREMIUM（根据样本量，通常每10mL稀释血样对应3-4mL介质）。
样本叠加：用吸管沿管壁缓慢将稀释血样叠加于介质液面上，避免破坏密度梯度界面。
离心分离：水平转子离心，400×g，室温（18-22℃）离心30-40分钟（无制动）。
细胞收集：离心后管内形成明显分层，中间云雾状白膜层即为单核细胞层，用吸管小心吸取该层细胞。
洗涤纯化：将收集的细胞用平衡液洗涤2-3次（200×g离心10分钟），去除残留介质与血小板，获得纯化的单核细胞。

八、详细使用方法
（1）试剂配制
1.稀释液与洗涤液
用于血液稀释和细胞洗涤的平衡盐溶液可按以下说明配制。其他稀释液和洗涤液如等渗无钙镁磷酸盐缓冲液（例如杜氏PBS）、盐溶液（例如汉克氏液）或细胞培养基（例如RPMI 1640）亦可使用。
2.平衡盐溶液
配制平衡盐溶液时，将一份A母液与九份B母液混合后灭菌。每个样本至少需处理20毫升。其他无菌标准盐溶液亦可使用。
3.Ficoll-Paque分离液
使用前需将Ficoll-Paque密度梯度介质预热至18°C至20°C。对于超过3毫升的样本，请参阅注意事项。
（2）样本制备
为确保分离的单核细胞具有高活性，应使用新鲜血液。样本制备需在18°C至20°C环境下进行。
1.取10毫升离心管，加入2毫升经去纤维蛋白或抗凝剂处理的血液，以及等体积的平衡盐溶液（最终体积为4毫升）。
2.通过反复倒置离心管或用移液管反复抽吸混合，使血液与缓冲液充分混匀。
（3）单核细胞分离操作流程
1.充分颠倒Ficoll-Paque介质瓶数次以确保混匀
使用注射器抽取Ficoll-Paque介质时：折断聚丙烯瓶盖，将注射器针头穿过密封隔膜。
使用移液管抽取Ficoll-Paque介质时：移除可折断的聚丙烯瓶盖。掀起铝环。取下金属密封片。移除银色圆环。取下橡胶塞。采用无菌操作技术，吸取所需体积的Ficoll-Paque介质。
2.向离心管中加入3ml Ficoll-Paque介质
3.将稀释后的血样（4ml）小心叠加在Ficoll-Paque介质溶液上层
重要提示：叠加样品时切勿混合Ficoll-Paque介质溶液与稀释血样
4.在18°C至20°C条件下以400g离心30至40分钟（应关闭离心机制动）
5.用无菌移液管吸除含血浆和血小板的上层液，注意不要扰动界面处的单核细胞层。含有血浆的上层液可保留备用
6.使用无菌移液管将单核细胞层转移至无菌离心管
（4）洗涤细胞分离物
1.估算转移的单核细胞体积。向离心管中的单核细胞加入至少3倍体积（约6毫升）的平衡盐溶液。
2.通过轻柔地反复吹打使细胞悬浮。
3.在18°C至20°C条件下，以400-500×g离心10~15分钟。
注：高速离心可提高单核细胞回收率。但若需同时去除血小板，建议采用较低离心速度（60~100×g）。
4.移除上清液。
5.将单个核细胞重悬于6至8毫升平衡盐溶液中。
6.在18°C至20°C条件下，以400至500×g离心力（或60至100×g用于去除血小板）离心10分钟。
7.移除上清液。
8.将细胞沉淀重悬于适合实验应用的培养基中。
（5）粒细胞分离操作流程
1.按照右侧单核细胞分离流程（步骤1至6）所述方法，使用Ficoll-Paque密度梯度离心液进行密度梯度离心。
2.用无菌移液管吸弃Ficoll-Paque离心液上层，注意不要扰动红细胞层上方的粒细胞白膜层。
3.用移液管收集薄层粒细胞白膜层，转移至无菌离心管。
4.用至少五倍体积的平衡盐溶液重悬细胞，400×g离心15分钟。
5.使用任意选择的红细胞裂解液处理残留红细胞。
6.将粒细胞在18°C至20°C条件下以400-500×g离心10-15分钟。
7.弃去上清液。
8.用6-8ml平衡盐溶液重悬粒细胞。
9.在18°C至20°C条件下以400-500×g离心10分钟。
10.弃去上清液。
11.根据实验需求选用适当培养基重悬细胞沉淀。
（6）注意事项
1.抗凝剂：肝素、EDTA、柠檬酸盐、柠檬酸葡萄糖（ACD）和柠檬酸磷酸盐葡萄糖（CPD）可用作血样抗凝剂。脱纤维蛋白血无需抗凝剂。但脱纤维化处理会导致单核细胞得率降低，并可能增加红细胞污染。该过程还会造成单核细胞选择性流失。
Bøyum研究发现，使用EDTA替代肝素作为抗凝剂可获得纯度略高的单核细胞制备物。另有研究指出，在从外周血以外的来源纯化单核细胞时，添加肝素可能导致细胞悬液凝胶化。柠檬酸盐稳定的血样可能比其他抗凝剂获得更高质量的RNA和DNA，并产生更高的单核细胞得率。肝素会影响T细胞增殖并与多种蛋白质结合。EDTA适用于DNA检测，但会干扰Mg2+浓度并影响细胞遗传学分析。研究还显示EDTA抗凝血比肝素抗凝血具有更高的RNA得率。
2.血量：通过使用直径更大的离心管（同时保持与标准方法相同的Ficoll-Paque介质层高度2.4cm和血样高度3.0cm），可高效处理更大体积的血样。增加离心管直径不会影响所需分离时间。
3.血样储存：血样应无凝块并在采集后尽快处理以确保最佳结果。延迟处理会导致细胞活性丧失、回收率降低及粒细胞/红细胞污染增加。研究表明室温储存24小时会导致淋巴细胞得率下降、表面标志物表达改变及有丝分裂原刺激反应减弱。
4.死细胞去除：使用Ficoll-Paque PLUS进行细胞分离时可去除死细胞。
5.密度与温度：密度梯度分离的温度受室温、离心机温度、密度梯度介质温度及液体样本温度影响。需注意"室温"存在地域差异（如欧洲通常指20°C，北美则>20°C）。已知Ficoll-Paque产品密度随温度升高而降低，例如Ficoll-Paque PREMIUM（1.077 g/ml）在20°C、22°C和25°C时密度分别为1.0772、1.0767和1.0758。
6.病理血样：上述标准方法适用于健康人外周血单核细胞纯化。对于感染或癌症等病理状态供体的样本可能获得不同结果（详见Ficoll-Paque PLUS和Ficoll-Paque PREMIUM的扩展应用章节第15页）。
7.血小板去除：若需彻底清除单核细胞组分中的血小板，可在Ficoll-Paque PLUS上层叠加4%-20%蔗糖梯度进行二次离心。该方法可有效去除血小板污染，血小板将滞留于蔗糖梯度顶部而单核细胞会沉降至Ficoll-Paque PLUS层顶部。替代方案是在分离前用5'-二磷酸腺苷（ADP）诱导血小板聚集去除。
（7）性能故障排查
若按照推荐标准流程使用，Ficoll-Paque PLUS和Ficoll-Paque PREMIUM应能稳定分离人外周血单个核细胞，结果如第4页所示。如前所述，Ficoll-Paque PREMIUM 1.073和Ficoll-Paque PREMIUM 1.084会分离出密度亚群略有差异的单个核细胞制剂。但某些实验参数的偏差可能导致结果不佳，本故障排查表旨在帮助快速识别并修正导致性能下降的问题。

九、包装与运输
包装：6瓶×100mL/盒，棕色玻璃瓶包装，避光保护。
运输条件：2~8℃冷链运输，避免极端温度。