热敏 USER® II 酶

Thermolabile USER^® II Enzyme
热敏 USER^® II 酶

USER（尿嘧啶特异性切除试剂）酶（1）在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。USER 酶是尿嘧啶-DNA 糖苷酶（UDG）和核酸内切酶 VIII 的混合物。UDG 可催化切除尿嘧啶碱基，形成一个碱基（脱嘧啶）位点，同时保持结构完整的磷酸二酯键（2,3）。核酸内切酶 VIII 的裂解酶活性使脱碱基位点 3´ 和 5´ 端的磷酸二酯键断裂，从而释放无碱基的脱氧核糖（4,5）。

USER 应用包括：

• 定向 RNA 测序
• NEBNext 接头切割
• USER 克隆

图 1：USER 酶

尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）催化切除尿嘧啶碱基，形成一个脱碱基（脱嘧啶）位点，同时保持磷酸二酯键骨架结构完整。核酸内切酶 VIII 的裂解酶活性使脱碱基位点 3´ 和 5´ 端的磷酸二酯键断裂，从而释放无碱基的脱氧核糖。USER（尿嘧啶特异性切除试剂）酶结合了这两种酶活性，在尿嘧啶残基位置产生一个单核苷酸缺口。

图 2：USER 酶（NEB #M5505）、热敏 USER II 酶（NEB #M5508）和热稳定 USER III 酶（NEB #M5509）在 DNA 切割后产生不同的功能性末端产物。



除了最佳反应温度不同（USER 和热敏 USER II 酶为 37℃，热稳定 USER III 酶为 65℃）以及热失活能力不同（仅限热敏 USER II 酶），不同的 USER 酶还会在切割后产生不同的 3’ 和 5’ 末端产物。USER 酶（NEB #M5505）包含核酸内切酶 VIII，在切割后产生 3’ 和 5’ 磷酸末端。热敏 USER II 酶（NEB #M5508）包含核酸内切酶 III，在切割后产生 3′-磷酸-α、β-不饱和醛和 5′ 磷酸末端。热稳定 USER III 酶（NEB #M5509）包含核酸内切酶 IV，并产生 3′-羟基和 5′-脱氧核糖磷酸。

• 产品组分信息

  本产品提供以下试剂或组分：

  

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位指在 10 μl 反应体系中，37℃ 条件下，15 分钟能切刻 10 pmol 含一个尿嘧啶碱基的 34 mer 双链寡核苷酸所需的酶量。

    反应条件

    1X rCutSmart™ 缓冲液
    Incubate at 37°C

    1X rCutSmart™ 缓冲液
    50 mM Potassium Acetate
    20 mM Tris-acetate
    10 mM Magnesium Acetate
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    5 mM NaCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    175 µg/ml Recombinant Albumin
    50% Glycerol
    50 mM KCl
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    否
     
     

  • 注意事项

    1. USER 酶在所有经测试的市售 PCR 缓冲液中都有活性。在 TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA）中也具有 100% 的活性。
    2. 37℃ 温育。

  • 参考文献

    1. Bitinaite, J. unpublished observations.
    2. Lindhal, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B. and Sperens, B. (1977). J. Biol. Chem.. 252, 3286-3294.
    3. Lindhal, T. (1982). Annu. Rev. Biochem.. 51, 61-64.
    4. Melamede, R.J., Hatahet, Z., Kow, Y.W., Ide, H. and Wallace, S.S. (1994). Biochemistry. 33, 1255-1264.
    5. Jiang, D., Hatahet, Z., Melamede, R.J., Kow, Y.W. and Wallace, S.S. (1997). J. Biol. Chem.. 272, 32230-32239.