bca蛋白定量法原理

BCA蛋白定量法原理

 

在蛋白zhìzǔxué研究中，准确测定dànbáizhì浓度是后续实验的基础。BCA蛋白定量法原理基于双缩脲反应，通过碱性条件下dànbáizhì将Cu²⁺还原为Cu⁺，后者与BCA试剂形成紫色复合物。该复合物在562 nm处有zuì大吸收峰，其吸光度与dànbáizhì浓度呈正比。与传统的Lowry法相比，BCA蛋白定量法原理具有显著优势：反应产物稳定性更高（室温下可维持1小时以上），抗干扰能力更强（可耐受高达5%的SDS、1% Triton X-100等去垢剂），且灵敏度达到0.5-20 μg/mL。反应体系中，BCA（二kuílín甲酸）作为显色剂，在碱性环境中与Cu⁺形成2:1的螯合物，每个螯合物分子含有两个BCA配体。反应温度通常选择37℃或60℃以加速反应，其中60℃条件下30分钟即可完成反应，而37℃需要2小时。值得注意的是，不同dànbáizhì因氨基酸组成差异（特别是含巯基或酚羟基的氨基酸）会表现出不同的显色效率，因此建议使用与待测样品同源的dànbáizhì作为标准品。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

BCA蛋白定量法原理的核心反应分为两个阶段：首先是dànbáizhì在碱性环境中将Cu²⁺还原为Cu⁺，这个步骤与双缩脲反应类似；然后是Cu⁺与BCA试剂特异性结合形成紫色复合物。反应的zuìjiāpH范围为11-12，通常使用碳酸钠-氢yǎnghuànà缓冲体系维持。值得注意的是，还原糖、DTT等高浓度还原剂会产生干扰，但适当稀释样品或采用改良方案可消除影响。微孔板法的检测下限可达0.5 μg/mL，而常规试管法则为5 μg/mL。

 

在方法优化方面，BCA蛋白定量法原理允许通过调整反应温度和时间来提高灵敏度。研究发现，60℃反应可显著增强低浓度蛋白的检测信号，但对热不稳定蛋白可能造成干扰。标准曲线应当与样品测定同步进行，因为环境温度、试剂批次等因素会影响显色强度。对于复杂样品，建议先进行适当稀释，使测定值落在标准曲线线性范围内（通常为0.2-1.0吸光度单位）。

 

从应用角度看，BCA蛋白定量法原理特别适合细胞裂解液、组织匀浆等复杂样品的检测。其抗干扰特性使其在含有核酸、脂类等杂质的样品中仍能保持较好准确性。与Bradford法相比，BCA法对去垢剂的耐受性更好，但与Lowry法一样会受到高浓度EDTA的抑制。现代改良配方通过加入增强剂，已将兼容性扩展到含1 M NaCl或20%乙醇的样品体系。

 

常见问题：

 

Q1. BCA法测定时为何会出现标准曲线线性不佳的现象？

A：这通常与Cu²⁺还原不wánquán或BCA试剂降解有关。确保使用新鲜配制的工作液（BCA与CuSO₄按50:1现配现用），避免使用金属离子污染的器皿。同时检查分光光度计比色皿的透光面是否清洁，建议用石英比色皿进行测定。

 

Q2. 如何校正不同dànbáizhì之间的显色差异？

A：可采用"表观回收率"法：选取样品中含量较高的3-4种dànbáizhì分别制作标准曲线，计算其相对于BSA的校正因子（如IgG的校正因子通常为1.2-1.4）。更jīngquè的做法是使用凯氏定氮法预先标定样品自身的dànbáizhì含量作为基准。