细胞ROS检测—Highly Sensitive DCFH-

ROS Reactive Oxygen Species 主要是在线粒体中合成 ATP时所产生的高活性氧簇。ROS对细胞内的信号传导和吞噬作用等免疫机能起着重要的作用。另一方面， ROS对DNA和蛋白质的氧化作用也是各种疾病和细胞衰老的原因之一。

最近的研究发现，由二价铁所诱发的芬顿反应所引起的一种新的细胞死亡方式（铁死亡，Ferroptosis）的研究领域里 ROS也被广泛关注，检测 ROS的需求和意义也在不断升高 1)。目前在检测 ROS时，使用最多的试剂是DCFH-DA。但是 DCFH-DA往往有灵敏度低、样品荧光与背景的差别不明显等问题 。本试剂盒是一种高灵敏度的ROS检测试剂盒，而且配套使用本试剂盒内附带的 Buffer，可以在相对更低的细胞毒性下对 ROS进行高灵敏度检测。

与市面现有试剂的比较

活性氧反应的选择性

高灵敏度DCFH-DA与常规DCFH-DA对活性氧（ROS）的反应性相同。
另外，由于具有与DCFH-DA相同的荧光特性（λex：505nm，λem：525nm），因此能够以相同的激发/荧光波长进行检测。

检测灵敏度的比较

用DCFH-DA和ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA-分别对过氧化氢（1×10 ⁴细胞/ ml）处理的HeLa细胞进行染色，并比较细胞内ROS的荧光结果。结果显示，在任何检测仪器中，同仁化学ROS检测试剂盒-高灵敏度DCFH-DA都以比DCFH-DA拥有更高的灵敏度。

（1）荧光显微镜检测

<检测条件>
Ex.488 nm / Em.500 -560 nm
细胞种类：HeLa细胞

（2）使用荧光酶标仪检测

<检测条件>
Ex.490-520 nm / Em.510-540 nm
细胞种类：HeLa细胞

（3）使用流式细胞仪检测

<检测条件>
FITC激发电压：215 V
细胞种类：HeLa细胞

一.Erastin处理的A549细胞的内在性ROS的检测

1. 向 ibidi 8-well plate中接种A549细胞 (1××10⁴ cells/ml, DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-37°C 、 5% CO2培养箱内过夜培养 。

2. 去除培养基，加入用 DMEM培养基 稀释好的 50 μμmol/l的 Erastin溶液， 37°C 、 5% CO₂培养箱过夜培养 。

3. 去除上清，HBSS清洗 2次 ，加入 Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solution 37°C 、 5% CO₂培养箱培养 30 min。

4. 去除Working solution HBSS清洗 2次 ，再次加入 HBSS，用荧光显微镜观察。

二.LPS处理的巨噬细胞内源性ROS的检测

用LPS（脂多糖）处理的RAW264.7细胞中细胞内ROS的变化的荧光成像结果显示，LPS处理可增加细胞内ROS。

<检测条件>
细胞内ROS（高灵敏度DCFH-DA染料）：Ex. 488 nm / Em.500 -560 nm

<实验操作>
1.在ibidi 8孔板中接种RAW264.7细胞（3×104细胞，DMEM，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素）
2.培养箱（37℃，5％）过夜培养
3.除去培养基，用HBSS洗涤细胞两次，然后添加用DMEM培养基稀释的500 ng / ml LPS
4.培养箱（37°C，5％CO2） 孵育20小时
5.除去上清液，用HBSS洗涤细胞两次，然后添加高灵敏度DCFH-DA染料工作液。
6.培养箱（37°C，5％CO2）培养30分钟
7.培养30分钟后除去工作溶，用HBSS洗涤细胞两次后再添加HBSS并用荧光显微镜观察。

三.柳氮磺吡啶(SSZ)引起的细胞内代谢变化

向A549细胞添加已知抑制胱氨酸/谷氨酸转运蛋白（xCT）的柳氮磺吡啶（SSZ）之后，确认了细胞内的ROS、ATP、α-谷氨酸（α-KG）、谷胱甘肽（GSH）的变化和谷氨酸释放量的变化。

结果显示，由于SSZ的添加，细胞内的ATP、谷胱甘肽（GSH）以及谷氨酸的释放量减少，细胞内的α-谷氨酸和ROS增加。

1、S. Kato, "Effects of platinum‑coexisting dopamine with X‑ray irradiation upon human glioblastoma cell proliferation", Hum. Cell, 2021, doi:10.1007/s13577-021-00591-3.

2、K. Kanno, T. Sakaue, M. Hamaguchi, K. Namiguchi, D. Nanba, J. Aono, M. Kurata, J. Masumoto, S. Higashiyama, H. Izutani, "Hypoxic Culture Maintains Cell Growth of the Primary Human Valve Interstitial Cells with Stemness", Int. J. Mol. Sci. 2021, doi:10.3390/ijms221910534.

3、C. Fang, L. Wu, M. Zhao, T. Deng, J. Gu, X. Guo, C. Li, W. Li, X. Zeng, "Periodontitis Exacerbates Benign Prostatic Hyperplasia through Regulation of Oxidative Stress and Inflammation", Oxid. Med. Cell. Longevity, 2021, doi:10.1155/2021/2094665.

4、M. Tmoi and S. Shigeoka, "CP12 Is Involved in Protection against High Light Intensity by Suppressing the ROS Generation inSynechococcuselongatus PCC7942", Plants, 2021, doi:10.3390/plants10071432.

5、S. Xia, Z. Ma, B. Wang, F. Gao, C. Yi, X. Zhou, S. Guo, L. Zhou, "In vitro anti-synovial sarcoma effect of diallyl trisulfide and mRNA profiling", Gene, 2021, doi:10.1016/j.gene.2021.146172.

6、Z. Luo, Q. Gao, H. Zhang, Y. Zhang, S. Zhou, J. Zhang, W. Xu, J. Xu, " Microbe-derived antioxidants attenuate cobalt chloride-induced mitochondrial function, autophagy and BNIP3-dependent mitophagy pathways in BRL3A cells", 2022, doi:10.1016/j.ecoenv.2022.113219.

7、Z. Xie, T. Kawasaki, H. Zhou, D. Okuzaki, N. Okada and M. Tachbana, "Targeting GGT1 Eliminates the Tumor-Promoting Effect and Enhanced Immunosuppressive Function of Myeloid-Derived Suppressor Cells Caused by G-CSF", Front. Pharmacol., 2022, doi:10.3389/fphar.2022.873792.

8、Y. Fujita, M. Iketani, M. Ito, I. Ohsawa, "Temporal changes in mitochondrial function and reactive oxygen species generation during the development of replicative senescence in human fibroblasts", 2022, Exp. Gerontol., doi:10.1016/j.exger.2022.111866.

9、Hao Gu, Yuhui Zhu, Jiawei Yang, Ruixue Jiang, Yuwei Deng, Anshuo Li, Yingjing Fang, Qianju Wu, Honghuan Tu, Haishuang Chang, Jin Wen, Xinquan Jiang,”Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration.Advanced Science”，2023, Advanced Science, doi：10.1002/advs.202302136