多肽质谱鉴定原理

多肽质谱鉴定原理

 

多肽质谱鉴定是现代蛋白zhìzǔxué研究中的核心技术手段，其基本原理是通过质谱仪测定多肽的质荷比（m/z）和碎片离子信息，结合生物信息学分析实现多肽序列的jīngzhǔn鉴定。该技术路线通常包括三个关键环节：样品前处理、质谱数据采集和数据库检索。在液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）系统中，酶解后的多肽混合物首先通过反相色谱分离，随后在离子源中被电离形成带电多肽离子。电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）是两种zuì常用的电离方式，其中ESI更适合于液相色谱联用系统，而MALDI则常用于高通量点靶分析。电离后的多肽进入质量分析器，四极杆-飞行时间（Q-TOF）和轨道阱（Orbitrap）是目前主流的两种高分辨质量分析器，其质量精度可达ppm甚至sub-ppm级别。在串联质谱（MS/MS）模式下，选定前体离子经碰撞诱导解离（CID）或高能碰撞解离（HCD）产生特征性碎片离子谱，这些碎片离子携带了多肽序列的结构信息。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

多肽质谱鉴定的核心在于碎片离子谱图的解析。在低能碰撞条件下，多肽主链断裂主要产生b系列（N端保留）和y系列（C端保留）离子，这些离子的质量差对应特定氨基酸残基的质量。现代质谱仪配备的脉冲碎裂技术如电子转移解离（ETD）可更好地保留翻译后修饰信息。数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）是两种主要的质谱扫描策略，DDA选择丰度zuì高的离子进行碎裂，而DIA则对特定m/z窗口内的所有离子进行无差别碎裂，后者在定量重复性方面更具优势。在获得原始质谱数据后，通过搜索引擎如SEQUEST、Mascot或Andromeda将实验谱图与理论谱图进行匹配，匹配算法考虑碎片离子强度、质量误差和离子系列连续性等多个维度参数。

 

多肽质谱鉴定的准确性受多种因素影响。质量校准是保证数据可靠性的前提，通常采用已知质量的校准品进行仪器校准。动态排除设置可避免对同一前体离子的重复碎裂，提高鉴定通量。对于复杂样品，分级策略如高pH反相色谱分级或强阳离子交换色谱能显著增加低丰度多肽的鉴定数量。在数据库检索环节，设置适当的容差参数（通常为10-20 ppm前体离子质量容差和0.02-0.05 Da碎片离子质量容差）和酶切特异性参数至关重要。错误发现率（FDR）控制通过目标-诱饵数据库策略实现，一般要求蛋白水平FDR≤1%。近年来，基于深度学习的谱图预测算法如Prosit大幅提升了鉴定灵敏度，特别是对低强度谱图的解析能力。

 

多肽质谱鉴定在翻译后修饰研究中有dútè优势。磷酸化、乙酰化等修饰会导致多肽质量发生特定偏移，通过设置可变修饰参数可系统筛查修饰位点。同位素biāojìdìng量（如TMT、iTRAQ）和无biāojìdìng量（LFQ）技术可与多肽质谱鉴定无缝衔接，实现dànbáizhì组的相对定量。对于新物种或基因组注释不完善的样本，de novo测序技术不依赖数据库即可推导多肽序列，但其准确性受谱图质量影响较大。随着质谱灵敏度和扫描速度的提升，单细胞蛋白zhìzǔxué已成为可能，这对样品前处理提出了更高要求。微流控芯片与质谱联用技术正在推动该领域向纳升级甚至皮升级样品量发展。

 

常见问题：

 

Q1. 如何评估多肽质谱鉴定结果的可靠性？

A：除常规的FDR控制外，应检查谱图匹配质量分数（如Mascot ion score或Andromeda score）、序列覆盖度、匹配碎片离子数量及分布。理想情况下，y/b离子应呈现连续分布且高强度碎片能解释大部分谱图信号。对于修饰位点定位，需考察修饰特异性碎片离子及定位概率分值。

 

Q2. 在复杂基质中如何提高低丰度多肽的鉴定率？

A：可采用免疫亲和富集、尺寸排阻预分级或肽段水平的高pH反相分级等方法降低样品复杂度。质谱采集时优化动态排除时间（通常设为15-30秒）、采用窄隔离窗口（1-2 Th）的DDA方法或转向DIA模式。数据采集后可采用谱图库搜索或深度学习辅助的谱图解释策略提升低强度信号解析能力。