电泳分离技术

电泳分离技术的原理与应用进展

 

在分子生物学和生物化学研究中，带电粒子在电场作用下发生迁移的现象构成了分离复杂生物分子的基础原理。这种基于电荷-质量比差异的分离方法自20世纪30年代Tiselius建立移动界面电泳以来，已经发展成为现代生命科学研究bùkěhuòquē的核心技术。电泳分离技术的物理本质在于：当置于电场中时，带电生物大分子（如dànbáizhì、核酸）会受到与其净电荷量成正比、与摩擦阻力成反比的驱动力，不同分子因表面电荷分布、分子构象及水化程度等差异而呈现特征性迁移速率。在支持介质（如聚bǐngxīxiānàn或琼脂糖凝胶）存在的情况下，分子筛效应进一步增强了分离分辨率，使得仅相差单个电荷或几个碱基对的分子也能被有效区分。当前电泳分离技术的应用范围已从zuì初的血清蛋白分析扩展到基因组学、蛋白zhìzǔxué、药物开发等多个前沿领域，其技术变体包括SDS-PAGE、等电聚焦、双向电泳、毛细管电泳等十余种zhuānyè化方案，每种方法针对特定类型的生物分子优化了分离条件与检测灵敏度。

 

凝胶电泳的技术原理与分类

 

聚bǐngxīxiānàn凝胶电泳（PAGE）作为高分辨率分离dànbáizhì的标准方法，其分离机制依赖于两个物理效应：电荷效应和分子筛效应。在非变性条件下，dànbáizhì的迁移速率由其净电荷与流体动力学半径共同决定；而在SDS存在时，dànbáizhì解聚为均一带负电的SDS-多肽复合物，此时分离仅反映分子量差异。梯度凝胶通过bǐngxīxiānàn浓度梯度（通常4-20%）可同时分离分子量跨度达10-200kDa的dànbáizhì混合物。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。琼脂糖凝胶电泳则主要应用于核酸分析，其孔径较大（0.5-3%琼脂糖浓度对应不同片段大小），通过EB或更安全的荧光染料染色可实现ng级DNA的检测。脉冲场凝胶电泳（PFGE）采用交替变换方向的电场，能分离兆碱基级别的超大DNA分子，在微生物分型研究中具有dútè价值。

 

毛细管电泳的技术革新

 

20世纪80年dàifā展起来的毛细管电泳（CE）将电泳分离技术推向微量化与自动化新高度。在内径25-100μm的熔融石英毛细管中，纳升级样品在高压电场（通常15-30kV）驱动下完成分离，其理论塔板数可达10^5-10^6/m，远高于传统凝胶电泳。毛细管区带电泳（CZE）模式适用于小分子和肽段分析；胶束电动色谱（MEKC）通过添加表面活性剂实现中性分子的分离；而毛细管凝胶电泳（CGE）则继承PAGE的分子筛原理，在基因组测序中发挥关键作用。CE与质谱联用（CE-MS）进一步拓展了其在代谢组学和蛋白zhìzǔxué中的应用深度，可同时获得迁移时间和质荷比二维信息。

 

双向电泳的复杂体系解析能力

 

双向电泳（2-DE）通过正交组合等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种分离模式，能在单块凝胶上解析数千种dànbáizhì。dìyī维IEF根据dànbáizhì等电点差异分离，使用固定化pH梯度胶条（IPG，通常pH3-10）可获得0.001pH单位的分辨率；第二维SDS-PAGE则按分子量进一步分离。荧光差异凝胶电泳（DIGE）通过Cy2、Cy3和Cy5标记不同样本，在同一块胶上比较三组样品表达差异，将定量精度提高到±15%。虽然质谱技术发展迅速，但2-DE在翻译后修饰研究和dànbáizhì异构体检测方面仍具bùkětìdài性。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。现代图像分析软件（如ImageMaster）能自动检测和匹配>90%的dànbáizhì斑点，显著提高了数据可靠性。

 

电泳分离技术的质量控制要点

 

电泳分离技术的重现性依赖于严格的参数控制。在SDS-PAGE中，bǐngxīxiānàn与甲叉双bǐngxīxiānàn的比例（通常29:1）决定交联度，guòliúsuānǎn（APS）和TEMED的浓度影响聚合速度与凝胶孔径均一性。缓冲系统选择尤为关键：Tris-Glycine（pH8.3）是SDS-PAGE的标准体系；Tris-Tricine系统更适合小分子量肽段；而碱性缓冲液（如Tris-Borate-EDTA）常用于核酸分析。温度控制直接影响分离效率，毛细管电泳通常配备液冷系统维持恒温（±0.1℃）。对于定量分析，内标物的使用（如预染蛋白Marker或DNA ladder）可校正迁移率偏差，而SYPRO Ruby等荧光染色法的线性范围比考马斯亮蓝宽100倍。

 

常见问题：

 

Q1. 为什么dànbáizhì在非变性PAGE中的迁移率不能准确预测其分子量？

 

A：非变性条件下dànbáizhì保持天然构象和电荷分布，迁移率受净电荷、分子形状及水化层厚度共同影响。例如，带大量正电荷的溶菌酶（pI≈11）在pH8.8的缓冲体系中会快速向阳极迁移，而相同分子量的酸性蛋白可能迁移较慢。此外，纤维状蛋白（如胶原蛋白）比球形蛋白（如血清白蛋白）具有更大的流体动力学半径，导致异常迁移行为。

 

Q2. 毛细管电泳中电渗流（EOF）如何影响分离效率？

 

A：熔融石英毛细管表面硅羟基在pH>3时解离形成负电荷层，吸引阳离子形成双电层，在电场作用下产生朝向阴极的EOF。EOF速率通常比分析物电泳速率高5-7倍，可加速分离但可能降低分辨率。通过毛细管涂层（如聚bǐngxīxiānàn）或缓冲液添加剂（如十六烷基三甲基溴化铵）可调控EOF。在MEKC中，EOF还是驱动中性分子迁移的主要动力。