本试剂盒仅供科研使用
高铁还原酶(Ferric reductase,FCR)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS7410F 分光法 48 样)
一、产品简介:
高铁还原酶(Ferric reductase,FCR)催化高铁螯合物中的 Fe3+还原为 Fe2+,在部分物
种铁元素的吸收中有重要作用。
高铁还原酶(FCR)可以催化 Fe3+还原为 Fe2+,Fe2+再与亚铁嗪(ferrozine)生成紫红
色化合物,该有色物质在 562nm 处有特征吸收峰,通过测定在 562nm 下的增加速率即
可得出该酶活大小。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体×2 支
4℃保存
用前甩几下或离心使粉剂落入底
部,分别加1.1mL蒸馏水溶解备用。
用不完的试剂分装后-20℃保存,禁
止反复冻融,三天内用完。
试剂二
液体×2 支
4℃保存
试剂三
粉体×1 支
4℃保存
临用前甩几下使粉体落入底部,再
加 2.4mL 蒸馏水溶解备用。
试剂四
液体 25mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
液体×1 支
4℃保存
标准品
液体 1mL×1 支
4℃保存
三、所需仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、可调式移液器、水浴锅或恒温培养
箱、低温离心机、蒸馏水。
四、高铁还原酶(FCR)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、 样本制备:
① 组织样本:
取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 5min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:澄清的液体可直接检测;若浑浊则离心后取上清液检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min,设定波长到 562nm,蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)中依次加入:本试剂盒仅供科研使用
2
【注】若△A 的值在零附近,可增加样本加样体积 V1(如增至 240μL,则试剂四相应减少);
或延长反应时间 T(如增至 60min);或增加样本取样质量 W;则改变后的 V1、T 和 W
需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、标准曲线:y = 0.0249x - 0.0087:x 为标准品摩尔质量(nmoL),y 为ΔA。
2、按样本鲜重计算:
单位定义:每克组织每分钟催化生成 1nmoL Fe2+定义为一个酶活单位(U)。
FCR (nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0087)÷0.0249]÷(W×V1÷V)÷T=8.4×(ΔA+0.0087)÷W
3、按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每毫克组织蛋白每分钟催化生成 1nmoL Fe2+定义为一个酶活单位(U)。
FCR (nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0087)÷0.0249]÷(V1×Cpr)÷T=8.4×(ΔA+0.0087)÷Cpr
4、按照液体体积计算:
单位定义:每毫升液体每分钟催化生成 1nmoL Fe2+定义为一个酶活单位(U)。
FCR (nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.0087)÷0.0249]÷V1÷T=8.4×(ΔA+0.0087)÷Cpr
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.16mL;
T---反应时间,30min;
W---样本质量,g;
500---细菌/细胞数量,万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 标准品母液(15μmoL/mL);把母液用蒸馏水稀释成以下浓度:0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16,
0.2μmoL/mL。也可根据实际来调整浓度。
2 40μL 标准品+10μL 试剂三+150μL 试剂四,混匀,室温静置 5min 后于 562nm 处读
取吸光值 A,依据结果即可制作标准曲线。
试剂名称(
μL)
测定管
样本
160
试剂一
40
试剂二
40
试剂三
40
试剂四
480
试剂五
40
充分混匀,于波长 562nm 处读取吸光值 A1,
室温(25℃)孵育 30min 后读取 A2,
△A=A2-A1。