本试剂盒仅供科研使用
一氧化*（NO）含量测定试剂盒说明书
（货号：WS2310F 分光法 48 样）
一、产品简介：
一氧化*（NO）广泛分布于生物体内，作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传
递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。
由于一氧化*（NO）本身极不稳定，在细胞内很快代谢为硝酸盐和亚硝酸盐，本试剂
盒采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐，然后与改良的 Griess Reagent 反应生成在
530nm 处有特征吸收峰的有色物质，通过测定其吸光值的变化即可计算出待检样本中总一
氧化*（NO）含量。
二、试剂盒组分与配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体×2 支
-20℃保存
用前甩几下或离心使粉剂落入底部，分别加
1.5mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后
-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。
试剂二
液体 1mL×1 支
-20℃保存 若一次性用不完，可分装保存，避免反复冻融。
试剂三
液体μL×2 支
-20℃保存
第一次开启前务必离心使微量液体落入底部
（避免试剂浪费）
,若一次性用不完，可分装保
存，避免反复冻融。
试剂四
粉体 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下或离心使试剂落入底部，再加
4.2mL 蒸馏水溶解。
试剂五
液体 12mL×1 瓶
4℃保存
临用前，可依据待检测样本数量，把试剂五和
六按照等比例混合成无色的反应 mix（注意观
察，若变粉色，则不能使用）。两天之内用完。
试剂六
液体 12mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体×1 支
4℃保存
用天平称取 6.9mg 的标准品至一新 EP 管中，
再加 1mL 蒸馏水溶解即 100μmol/mL，再用蒸
馏水稀释 1000 倍即 0.1μmol/mL，现配现用。
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、天平、研钵或匀浆器。
四、一氧化*（NO）含量的测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备
① 组织样本：
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，4℃×8000 rpm，离心 10min，取
上清液沸水（95-100℃）5min 后，于 12000 rpm 再离心 5min 后取上清，上清置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。
② 细胞/细菌样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液；
超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；4℃×8000 rpm，
离心 10min，取上清液沸水（95-100℃）5min 后，于 12000 rpm 再离心 5min 后取上清，本试剂盒仅供科研使用
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上清置冰上待测。
【注】:若增加样本量，按照细菌/细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：若浑浊先离心取澄清上清液液体检测，若是澄清液体直接检测即可（尿液样
本一般需做几个样本预测定，找出适合本批样本的稀释倍数 D）。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 530nm，蒸馏水调零。
② 其余试剂于 37℃预热 5min。在 EP 管中依次加入：
【注】1. 若△A 在零附近徘徊，可以增加样本取样量（如增加至 0.2g）。若 A 测定大于 1.5，可对样本用
蒸馏水稀释，则改变后的样本质量 W 和稀释倍数 D 需代入计算公式重新计算。
2. 若样本自身为较明显的红色或粉红色，可增设一个样本自身对照管：120μL 样本+150μL 蒸馏
水+400μL 的反应 mix，混匀，37℃避光反应 15min，于 530nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定
-A 对照。
3. 若加完反应 mix 出现浑浊沉淀（如血清样本），可于 5000rpm 室温离心 5min，测定管和空白
管都取出全部上清液至 1mL 玻璃比色皿中于 530nm 处读取吸光值 A。
五、结果计算：
1、按样本质量计算：
NO 含量(μmoL/g 鲜重)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(V1÷V×W)×D
=0.1×△A÷(A 标准-A 空白)÷W×D
2、按细胞/细菌数量计算：
NO 含量(nmoL/104 cell)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷(V1÷V×500)×D×103
=0.2×△A÷(A 标准-A 空白)×D
3、按液体体积计算：
NO 含量(μmoL/mL)=(C 标准×V1)×△A÷(A 标准-A 空白)÷V1×D
=0.1×△A÷(A 标准-A 空白)×D
C 标准---0.1μmol/mL；
V---加入提取液体积，1mL；
V1---反应中样品体积，0.12mL；
W---样品质量，g；
500---细胞数量，万；
D---稀释倍数，未稀释即为 1。
试剂名称（μL）
测定管
标准管（做一次） 空白管（做一次）
试剂一
40
40
40
试剂二
20
20
20
试剂三
10
10
10
样本
120
标准品
120
蒸馏水
120
混匀，37℃反应 60min
试剂四
80
80
80
混匀，37℃反应 30min
反应 mix
400
400
400
混匀，37℃避光反应 15min，全部上清液转移至 1mL 玻璃比色皿（光
径 1cm）中，于 530nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 空白。
文献和实验
技术资料