PhosphoWorks 比色ATP分析试剂盒

PhosphoWorks 比色ATP分析试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测ATP的试剂盒，三磷酸腺苷（ATP）在细胞能量，代谢调节和细胞信号传导中起着基本作用。它被称为细胞内能量转移的“货币分子单位”，以驱动活细胞中的许多过程和化学合成。 ATP也是细胞通讯的信号分子，在DNA和RNA合成中起重要作用。 AAT Bioquest提供了多种生物发光测定试剂盒，可通过重组萤火虫荧光素酶（目录号21610和21609）确定ATP的纳摩尔（nM）范围。这些试剂盒需要酶标仪，通常用于细胞活力或细胞毒性测定。 PhosphoWorks 比色ATP分析试剂盒基于一系列ATP诱导的酶偶联反应，产生过氧化氢，用我们的Amplite 红色底物在OD 570 nm处进行分光光度法定量。该测定法可在100 µL反应体积中检测到约3 µM ATP，而不受ADP和AMP的干扰。它为测定生物样品中的ATP水平提供了一种强大，简单且方便的测定方法。 PhosphoWorks 比色ATP分析是我们基于荧光素酶的ATP分析试剂盒的补充。，为您提供优质的PhosphoWorks 比色ATP分析试剂盒。 

样品实验方案

简要概述

1.准备ATP工作溶液（50 µL）
2.添加ATP标准液或测试样品（50 µL）
3.在室温下孵育10-30分钟
4.监测570 nm处的吸光度

 

溶液配制

1.制备储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1Amplite 红色底物储备液（200X）：
将30 µL DMSO（组分E）加入小瓶AmpliteTM Red Substrate（组分A）中，制成200X AmpliteTM Red Substrate储备液。

1.2ATP标准溶液（10mM）：
将0.5 mL的ddH2O加入到ATP标准溶液（组分D）的小瓶中，制成10 mM ATP标准溶液。

 

2.制备标准溶液

ATP标准

将10 µL的10 mM ATP标准溶液添加到990 µL 1X PBS缓冲液中，以生成100 µM ATP标准溶液（AS7）。 取100 µM ATP标准溶液（AS7），并按1：2进行系列稀释，以用1X PBS缓冲液获得系列稀释的ATP标准溶液（AS6-AS1）。

 

3.制备工作溶液

3.1将5ml测定缓冲液（组分C）添加到酶混合瓶（组分B）中，并充分混合。

3.2将25 µL 200X Amplite Red Substrate储备溶液添加到Enzyme Mix瓶中，并充分混合以制成ATP工作溶液。

 

样品示例及操作

表1.透明底部96孔微孔板中ATP标准品和测试样品的布局。 AS = ATP标准品（AS1-AS7，1.56至100 µM），BL =空白对照，TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
AS1	AS1	...	...
AS2	AS2	...	...
AS3	AS3
AS4	AS4
AS5	AS5
AS6	AS6
AS7	AS7

表2.每个孔的试剂组成。

孔	容积	试剂
AS1-AS7	50ul	连续稀释（1.56至100 µM）
BL	50ul	1 X PBS缓冲液
TS	50ul	测试样品

1.根据表1和2中提供的布局，准备ATP标准品（AS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 µL试剂，而不是50 µL。

2.将50 µL ATP工作溶液添加到ATP标准液，空白对照和测试样品的每个孔中，以使ATP总测定体积为100 µL /孔。 对于384孔板，将25 µL ATP工作溶液添加到每个孔中，总体积为50 µL /孔。

3.避光保存，室温下孵育反应10-30分钟。

4.用吸光度板读数器在570 nm的OD值处监测吸光度的增加。

 

参考文献

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