Amplite 荧光法cADP-核糖检测试剂盒

Amplite 荧光法cADP-核糖检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测核糖的试剂盒，cADP-核糖（cADPR）是衍生自NAD +的新型Ca2 +信使。 ADP-核糖基环化酶（ADPRC）催化从NAD +合成cADPR，但是在高浓度烟酰胺存在下，该反应可以逆转，从化学计量上从cADPR产生NAD +。 可以使用我们新开发的NAD传感器Quest Fluor NAD试剂检测生成的NAD +。 这使得可以在低nM范围内监视组织和细胞培养物中的cADPR。 使用Quest Fluor NAD试剂进行的NAD +检测对NAD +具有特异性，对NADH无反应。 荧光信号可以容易地检测到。 该测定可以在方便的96孔或384孔微量滴定板中进行。

样品实验方案

简要概述

1.准备并添加cADPR标准和/或测试样品（50 µL）
2.准备并添加ADRPC工作溶液（50 µL）
3.在室温下孵育1小时
4.添加40 µL Quest Fluor NAD探针
5.添加40 µL测定溶液
6.在室温下孵育20分钟
7.添加30 µL增强剂溶液
8.在室温下孵育20分钟
9.在Ex / Em = 420/480 nm处监控荧光强度

 

溶液制备

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
cADPR标准储备溶液（5 mM）：
将10 µL ddH2O加入cADPR标准样品瓶（组分F）中，并充分混合。 注意：未使用的cADPR储备溶液应以-20℃一次等份保存。

2.标准溶液

cADPR标准
注意：在测定溶液I（组分C）中准备cADPR系列稀释液。

3.工作溶液

ADPRC工作溶液：
将50 µL ddH2O加入ADPRC酶混合物（组分B）的小瓶中，并充分混合。 将全部内容物转移到5毫升测定溶液I（组分C）中，并充分混合。 注意：ADPRC工作溶液不稳定，请立即使用。

 

样品示例及操作

表1.黑色96孔微孔板中cADPR标准品和测试样品的布局。 ST = cADPR标准（ST1-ST7）； BL =空白对照； TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
ST1	ST1	...	...
ST2	ST2	...	...
ST3	ST3
ST4	ST4
ST5	ST5
ST6	ST6
ST7	ST7

表2.每个孔的试剂组成

孔	容积	试剂
ST1-ST7	50ul	连续稀释
BL	50ul	分析溶液I（组分C）
TS	50ul	测试样品

NAD生成测定

1.将50 µL cADPR标准液，空白对照和测试样品加到黑色固体96孔微孔板中（如表1和表2所示）。

2.在cADPR标准品，空白对照和测试样品的每个孔中添加50 µL /孔的ADPRC工作溶液。 注意：对于384孔板，请在每个孔中加入12.5 µL样品和12.5 µL ADPRC反应混合液。

3.避光保存，室温下孵育反应60分钟。

NAD检测分析

1.将40 µL Quest Fluor NAD探针（组分A）添加到cADPR标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（总计140 µL /孔），并充分混合。

2.向每个孔中加入40 µL分析溶液II（组分D）（总量为180 µL /孔），混合均匀。 注意：对于384孔板，将10 µL Quest Fluor NAD探针和10 µL分析溶液II加到每个孔中。

3.避光保存，室温下孵育反应10-20分钟。

4.向每个孔中添加30 µL增强剂溶液（组分E），使总NAD测定体积为210 µL /孔，并在避光的条件下在室温下孵育10-20分钟。 注意：对于384孔板，请添加7.5 µL增强剂溶液。

使用荧光板读数器在420/480 nm处监测荧光的增加。

 

参考文献

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