Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光

Amplite NADPH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光是美国AAT Bioquest研发的检测NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来完成。 该方法具有低灵敏度和高干扰，因为该测定在需要昂贵的石英微孔板的UV范围内进行。

这种Amplite 荧光NADPH检测试剂盒为检测NADPH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶再循环反应中的NADPH。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了来自生物样品的干扰。

Amplite 荧光NADPH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，在100μL检测体积（1μM;图1）中检测少至100皮摩尔的NADPH。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。 该测定试剂盒已用于筛选使用NADP / NADPH作为辅因子的酶活性。 它还被用于在基于细胞的测定中灵敏检测NADPH。 与其他商业试剂盒相比，该试验具有更高的信号/背景比。，为您提供优质的NADPH检测试剂盒。 

 

适用仪器

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荧光酶标仪
Ex:	540nm
Em:	590nm
Cutoff:	570nm
推荐孔板:	纯黑色孔板

96孔板测定示例

概述

准备NADPH反应混合物（50μL）

加入NADPH标准品或测试样品（50μL）

在室温下孵育15分钟 -  2小时在Ex / Em = 540/590 nm处

监测荧光增加

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

 

操作方法

1.准备NADPH原液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。

注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

2.准备NADPH反应混合物：

将10mL Amplite™NADPH测定缓冲液（组分B）加入NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NADPH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NADPH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

 

3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至100μM）：

3.1将50μLNADPH储备液（来自步骤1）加入450μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，得到100μM（100pmol / L）NADPH标准溶液。

注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL100μMNADPH标准溶液，进行1：3连续稀释，得到30,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADPH标准品系列稀释液。

3.3如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADPH的测试样品的系列稀释液加入到实心黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

 

表1实心黑色96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS
NS1	NS1	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品

 

表2每个孔的试剂组成

NADPH Standard	Blank Control	Test Sample
Serial Dilutions*: 50 μL	PBS: 50 μL	50 μL

*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份

 

4.在上清液反应中运行NADPH测定：

4.1将50μLNADPH反应混合物（来自步骤2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADPH测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADPH反应混合物。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（（佳Ex / Em = 540 / 590nm）下用荧光板读数器监测荧光增加。

注意1：平板的内容物也可以转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

注意2：对于基于细胞的NADPH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（cat＃20012）裂解细胞。

 

数据分析

        空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。

        注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。

图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在96孔黑色板中用Amplite 荧光NADPH测定试剂盒测量NADPH剂量反应。 低至1μM（100pmol /孔）可以在孵育1小时（n = 3）时检测到NADPH，而NADP没有响应。

 

参考文献

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