gst融合蛋白的电泳分离和染色

GST融合蛋白的电泳分离和染色

 

在重组蛋白纯化与检测领域，GST融合蛋白的电泳分离和染色是验证蛋白表达纯度、分子量及相互作用的关键技术路径。GST（gǔguānggāntàiS-转移酶）标签因其可溶性高、与gǔguānggāntài琼脂糖珠高效结合的特性，常作为融合标签用于原核或真核表达系统。通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚bǐngxīxiānàn凝胶电泳）分离GST融合蛋白时，需优化凝胶浓度（如10%-12%分离胶）以匹配目标蛋白的分子量范围，同时需注意还原条件（如加入β-巯基乙醇）确保蛋白wánquán解聚为单体形式。电泳结束后，考马斯亮蓝R-250或银染是常规染色方法，前者灵敏度约100 ng/条带，后者可达1 ng级；若需Western Blot验证，抗GST抗体可作为一抗进行特异性检测。对于大规模筛选，快速染色试剂（如InstantBlue）可缩短流程至15分钟，但具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。此外，GST融合蛋白的电泳分离和染色需警惕标签自身（26 kDa）对目标蛋白迁移率的潜在影响，尤其在分析小分子量蛋白时需通过对照实验排除干扰。

 

电泳条件优化与注意事项

 

GST融合蛋白的电泳分离和染色效果受多项参数影响。上样量通常控制在10-20 μg总蛋白，过量会导致条带拖尾；缓冲体系建议使用Laemmli配方（Tris-Glycine-SDS），pH 8.3-8.8以维持蛋白负电荷稳定性。对于分子量大于100 kDa的GST融合蛋白，可选用梯度胶（4%-20%）提高分辨率。染色阶段，考马斯亮蓝需固定（甲醇-乙酸）30分钟以上，而银染需严格避免水污染以防背景噪点。若需后续质谱分析，应选择兼容质谱的染色试剂（如Sypro Ruby）。

 

特殊场景下的技术适配

 

当GST融合蛋白电泳分离和染色用于非变性条件（Native-PAGE）时，需去除SDS和还原剂以维持蛋白天然构象及GST标签活性，此时染色宜采用负染（如lǜhuàjiǎ）或活性染料（如硝基蓝四唑）。对于膜蛋白等难溶性GST融合蛋白，可添加温和去污剂（如DDM）至电泳缓冲液，但需验证其对染色背景的影响。

 

常见问题：

 

Q1. GST融合蛋白在电泳中出现多条带，如何判断是否为降解产物？

A：可通过Western Blot使用抗GST抗体确认条带一致性，若所有条带均被识别，可能为翻译后修饰或蛋白酶切所致；若仅主带阳性，则需优化裂解条件（如添加蛋白酶抑制剂cocktail）。

 

Q2. 银染后GST融合蛋白条带背景过高，如何解决？

A：优先检查固定步骤是否充分（建议延长至1小时），并确保染色液新鲜配制。若问题持续，可改用硫代硫酸盐敏化步骤替代传统甲醛法，降低非特异性还原。