illumina测序的基本原理

Illumina测序技术的核心工作机制

 

Illumina测序的基本原理建立在"边合成边测序"(Sequencing by Synthesis, SBS)这一革命性概念之上。该技术通过可逆终止的荧光标记核苷酸实现高通量并行测序，其核心在于将DNA片段固定在流动槽表面并进行桥式扩增形成簇。每个测序循环中，DNA聚合酶将带有特定荧光标记的可逆终止子dNTP掺入新生链，随后通过激光激发和光学系统捕获荧光信号确定碱基种类。这种循环反应可jīngquè读取单碱基信息，同时保持jígāo的测序准确性。Illumina测序的基本原理特别依赖于两项关键技术突破：一是可逆终止子的化学设计，使得每次只掺入单个碱基；二是高密度簇生成技术，可在1平方厘米内形成数百万个独立测序单元。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

流动槽表面的寡核苷酸引物与文库DNA末端互补结合，经过桥式PCR扩增后，每个原始DNA分子可产生约1000个相同拷贝的簇，这一过程极大增强了后续荧光检测信号。Illumina测序的基本原理要求严格的荧光标记系统设计，四种dNTP分别标记不同荧光基团（如A-Cy3、C-Cy5、G-Texas Red、T-FITC），通过激光激发和CCD相机采集实现碱基判别。每个循环结束后，终止基团和荧光标记被化学切割，为下一个掺入循环做准备。这种循环反应通常可进行150-300次，产生高质量的双端读长数据。

 

测序过程中的化学环境控制至关重要。Illumina测序的基本原理依赖于jīngquè的pH值、离子浓度和酶活性调控，以确保高保真度的碱基掺入。系统采用zhuānlì的"双碱基编码"技术进一步降低错误率，即每个碱基通过两个独立检测步骤确认。流动槽的温度控制精度达到±0.1°C，为酶促反应提供zuì佳环境。数据处理阶段，图像分析算法将原始荧光信号转换为碱基序列，再通过比对参考基因组生成zuì终序列数据。

 

文库制备是Illumina测序的基本原理实现的前提条件。DNA样本首先被片段化并连接特定接头序列，这些接头含有与流动槽引物互补的区域。对于不同应用场景（如全基因组测序、外显子测序或RNA测序），文库构建方法有所差异，但核心都是确保DNA片段两端带有兼容的测序引物结合位点。质量控制步骤包括片段大小选择、浓度测定和接头连接效率评估，这些参数直接影响zuì终数据产出和质量。

 

常见问题：

 

Q1. Illumina测序中为何会出现phasing和pre-phasing现象？它们如何影响数据质量？

 

A：Phasing指部分DNA链在某个循环未能延伸，pre-phasing则是链延伸超过一个碱基。这些现象源于终止子切割不wánquán或酶促反应异常，会导致信号衰减和碱基识别错误。现代Illumina系统通过实时信号校正算法和优化反应条件将这类误差控制在0.1%以下。

 

Q2. 桥式扩增形成的簇密度为何需要jīngquè控制？过高或过低密度会产生什么影响？

 

A：zuì佳簇密度（约1000-1500k/mm²）平衡了信号强度和光学分辨率。密度过高会导致簇间信号串扰，增加碱基识别错误；密度过低则降低数据产出效率。Illumina的Patterned Flow Cell技术通过纳米级微井jīngquè控制簇位置，显著提高了信号质量。