lowry法测蛋白质原理

Lowry法测dànbáizhì原理及其应用

 

dànbáizhì定量分析是生物化学研究中zuì基础且关键的实验技术之一，其中Lowry法测dànbáizhì原理基于双缩脲反应与Folin-Ciocalteu试剂的协同作用机制。该方法由Oliver H. Lowry于1951年shǒucì系统描述，其核心在于dànbáizhì分子中的肽键在碱性条件下与铜离子形成紫红色络合物，同时làoānsuān和sèānsuān残基的酚基将磷钼酸-磷钨酸试剂还原生成深蓝色化合物。这种双重显色反应使得Lowry法测dànbáizhì原理具有较高的灵敏度（较双缩脲法提高约100倍），检测范围通常为20-200 μg/mL。反应过程中，首先在碱性环境中铜离子与dànbáizhì的肽键配位形成铜-dànbáizhì复合物，随后该复合物作为电子传递中介，促进Folin试剂被芳香族氨基酸还原。值得注意的是，Lowry法测dànbáizhì原理对反应条件极为敏感，温度、pH值及试剂添加顺序都会显著影响zuì终吸光度读数。实验操作时需严格控制反应时间（通常室温下40分钟显色稳定），且必须使用新鲜配制的试剂以避免氧化效应对结果的干扰。与Bradford法相比，Lowry法测dànbáizhì原理对去垢剂的耐受性较差，但受dànbáizhì氨基酸组成变异的影响相对较小。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

技术细节与优化

 

在实施Lowry法测dànbáizhì原理时，标准曲线的建立至关重要。通常采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，但其氨基酸组成与实际样品可能存在差异，这会导致约10-15%的系统误差。现代改进方案建议使用与实际样品相似的dànbáizhì作为标准品，或采用多点校准法。反应体系中碳酸钠-qīngyǎnghuànà混合碱液(pH 10-10.5)的稳定性直接影响铜离子络合效率，而酒石酸钾钠的加入可防止氢氧化铜沉淀的形成。Folin-Ciocalteu试剂的添加比例通常为反应总体积的1/10，添加后必须立即混匀以避免局部过还原现象。

 

干扰物质的处理是Lowry法测dànbáizhì原理应用中的关键挑战。浓度高于0.1%的SDS会使显色wánquán抑制，而1%的Triton X-100会导致约30%的信号降低。对于含干扰物的样品，可采用sānlǜyǐsuān沉淀法预处理，但需注意低分子量dànbáizhì可能在此过程中损失。某些还原剂如DTT在浓度超过1 mM时会显著干扰测定结果，而5 mM β-巯基乙醇可使吸光值降低40%。

 

方法比较与选择

 

相较于其他dànbáizhì定量方法，Lowry法测dànbáizhì原理在科研应用中展现出dútè优势。与紫外吸收法相比，其受核酸污染的影响较小（280nm处核酸的消光系数约为dànbáizhì的10倍）；与BCA法相比，其对还原糖的耐受性更好。然而，该方法对磷酸盐缓冲液的敏感性较高，50 mM磷酸盐可使测定结果偏差达25%。在自动化分析系统中，Lowry法测dànbáizhì原理可通过微孔板形式实现高通量检测，但需特别注意边缘效应导致的孔间变异。

 

常见问题：

 

Q1. 为什么Lowry法测定不同dànbáizhì时标准曲线斜率存在显著差异？

 

A：这主要源于不同dànbáizhì中làoānsuān和sèānsuān含量的差异。Folin-Ciocalteu试剂主要与这些芳香族氨基酸反应，例如溶菌酶（含6个làoānsuān）与BSA（含21个làoānsuān）的显色效率可相差2-3倍。jīngquè测定时应选用与目标蛋白氨基酸组成相近的标准品。

 

Q2. 如何解决Lowry法测定膜蛋白样品时常见的沉淀问题？

 

A：膜蛋白样品因含去垢剂易形成沉淀，可采取两步处理法：先用0.1% SDS在60℃处理10分钟使蛋白溶解，再加入等体积的2%脱氧胆酸钠（与SDS形成可溶性复合物）。注意zuì终SDS浓度需低于0.05%，否则会抑制显色反应。