筛选蛋白互作的技术方法有哪些

筛选蛋白互作的技术方法有哪些

 

在分子生物学和dànbáizhì组学研究中，筛选蛋白互作的技术方法是揭示dànbáizhì功能、信号通路和分子机制的核心工具。这些方法根据原理和应用场景可分为体内和体外两大类，每种技术均有其dútè的优势和适用范围。

 

酵母双杂交系统（Yeast Two-Hybrid, Y2H）是经典的体内筛选蛋白互作的技术方法之一，通过将目标蛋白与报告基因的转录激活域或DNA结合域融合，利用酵母细胞内的转录激活效应检测相互作用。该系统适用于大规模筛选，但可能漏检某些依赖翻译后修饰的互作。近年来，基于哺乳动物细胞的双杂交系统（如Mammalian Two-Hybrid）提高了对真核蛋白互作的检测灵敏度。

 

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和亲和纯化-质谱联用（Affinity Purification-Mass Spectrometry, AP-MS）是体外筛选蛋白互作的技术方法的重要代表。Co-IP利用抗体捕获目标蛋白及其结合复合物，随后通过Western blot验证互作蛋白；而AP-MS则通过高分辨率质谱直接鉴定互作蛋白，适合全局性互作网络分析。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）和生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）是实时、无标记的筛选蛋白互作的技术方法。SPR通过监测结合事件引起的折射率变化定量互作动力学参数（如结合常数KD），而BLI利用光干涉原理检测生物分子结合厚度变化。这两种技术对低亲和力互作的检测尤为敏感。

 

荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）和邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）则通过光学信号放大实现高时空分辨率的筛选蛋白互作的技术方法。FRET要求供体与受体荧光基团的距离小于10 nm，适用于活细胞动态监测；PLA通过DNA连接放大信号，可在固定组织中定位互作位点。

 

此外，交联质谱（Crosslinking-MS）通过化学交联稳定蛋白复合物，结合质谱鉴定互作界面，成为研究弱相互作用或瞬态复合物的有力工具。而噬菌体展示（Phage Display）通过文库筛选技术，可高效发现与目标蛋白结合的肽段或抗体。

 

常见问题：

 

Q1. 如何选择适合低丰度蛋白互作筛选的技术方法？

A：对于低丰度蛋白，建议采用信号放大技术如PLA或AP-MS。AP-MS通过高灵敏度质谱可检测到fmol级别的蛋白，而PLA通过DNA扩增将信号放大至可检测水平。若需定量动力学参数，可结合SPR或BLI优化捕获效率。

 

Q2. 酵母双杂交系统为何可能出现假阴性结果？

A：假阴性主要源于酵母细胞内缺乏哺乳动物特异的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化），或目标蛋白的折叠异常。可通过哺乳动物双杂交系统或补充修饰酶（如激酶共表达）改善。此外，某些互作依赖亚细胞定位（如膜蛋白），需选用分选杂交系统（Split-Ubiquitin Y2H）。