lowry法测蛋白质含量

Lowry法测dànbáizhì含量的原理与应用

dànbáizhì定量分析是生物化学和分子生物学研究中的基础实验技术，其中Lowry法测dànbáizhì含量因其高灵敏度和可靠性被广泛应用于实验室研究。该方法由Oliver H. Lowry于1951年shǒucì提出，基于双缩脲反应与Folin-Ciocalteu试剂的协同作用，通过比色法测定dànbáizhì浓度。其核心原理分为两步：首先，dànbáizhì在碱性条件下与铜离子（Cu²⁺）形成复合物，这一步骤类似于双缩脲反应；随后，复合物还原Folin-Ciocalteu试剂中的磷钼酸-磷钨酸，生成蓝色产物，其吸光度与dànbáizhì浓度成正比，通常在750 nm波长下检测。Lowry法测dànbáizhì含量的检测范围通常为5-100 μg/mL，灵敏度显著高于双缩脲法，但低于Bradford法。

Lowry法测dànbáizhì含量的关键优势在于其对不同dànbáizhì的响应相对均一，尤其适用于复杂混合物（如细胞裂解液或血清）的检测。然而，该方法易受多种干扰物质影响，如去垢剂（SDS、Triton X-100）、还原剂（DTT、β-巯基乙醇）以及高浓度盐类，这些物质可能抑制显色反应或导致背景值升高。因此，实验前需通过透析或沉淀去除干扰物。此外，显色反应需严格控制在10-30分钟内完成，因产物稳定性受时间影响。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定，但主要成本集中于Folin-Ciocalteu试剂和标准蛋白（如牛血清白蛋白，BSA）。

在操作流程上，Lowry法测dànbáizhì含量需配制碱性铜试剂（含NaOH和CuSO₄）与Folin-Ciocalteu试剂，两者按比例混合后与dànbáizhì反应。标准曲线的建立至关重要，通常采用BSA或酪蛋白作为标准品，覆盖预期浓度范围。值得注意的是，反应体系的pH需严格控制在10-10.5，以确保铜-dànbáizhì复合物的高效形成。现代改进方案中，部分研究者采用微板读板机替代分光光度计，以提升高通量检测效率。

常见问题：

Q1. Lowry法测dànbáizhì含量为何对làoānsuān和sèānsuān残基敏感？

A：Folin-Ciocalteu试剂的还原依赖于dànbáizhì中芳香族氨基酸（尤其是làoānsuān和sèānsuān）的酚羟基。这些残基在碱性环境下将电子转移给磷钼酸-磷钨酸复合物，生成蓝色钼蓝，其显色强度与这些氨基酸的含量直接相关。因此，dànbáizhì中làoānsuān或sèānsuān比例异常可能导致测定偏差。

Q2. 如何验证Lowry法测dànbáizhì含量中标准品与待测样品的显色一致性？

A：可通过“回收率实验”验证：在已知浓度的标准蛋白中添加待测样品，比较实测值与理论值的偏差。若回收率在95%-105%范围内，表明标准品与样品显色行为一致。此外，SDS-PAGE结合Lowry法可进一步确认样品中dànbáizhì组成是否影响测定结果。