GX100B 晶欣 重组人纤粘连蛋白片段 转染 * 2.

晶欣 重组人纤粘连蛋白片段 转染 *

 

简要描述：晶欣 重组人纤粘连蛋白片段 转染 * 产品货号：GX100B 

储存条件：-20℃

产品组分：重组人纤粘连蛋白 2.5mg，该试剂以1 mg/ml 溶液形式提供。【含有12.5 mM柠檬酸钠(pH 6.2)和1.25%蔗糖的无菌溶液。

储存条件：-20℃

产品组分：重组人纤粘连蛋白 2.5mg，该试剂以1 mg/ml 溶液形式提供。【含有12.5 mM柠檬酸钠(pH 6.2)和1.25%蔗糖的无菌溶液。】

产品介绍：

该重组人纤维连接片段（rFN-CH-296），由三个功能结构域组成：细胞结合域 、肝磷脂结合域和CS1位点。该片段通过协助靶细胞和病毒粒子的共定位来增强逆转录病毒介导的基因转导。其作用原理是：逆转录病毒载体与肝磷脂结合域结合，细胞表面VLA-5及 VLA-4分别与该纤连蛋白的细胞结合域 和 CS-1位点结合。

在经重组人纤粘连蛋白片段包被的培养容器表面，细胞与病毒载体高浓度共存，从而提高基因感染效率。

感染方案：

1.逆转录病毒与该重组人纤粘连蛋白片段包被的培养板结合，去除逆转录病毒上清液后加入靶细胞。但去除上清液会减少抑制性分子(例如，从生产细胞分泌的分子，如蛋白聚糖、病毒包膜蛋白)，从而降低病毒介导的基因转导效率。

2.细胞与病毒上清液混合并结合到重组人纤粘连蛋白片段包被的培养板上。

两种方案均可用于有效的基因转导。尽管方案1广泛适用，但具体实验方案可能仍需根据靶细胞、载体、靶基因进行修改。

实验方案：

1. 重组人纤粘连蛋白片段包被培养板的制备

将重组人纤粘连蛋白片段包被于培养板上，浓度20-100μg/ml的重组人纤粘连蛋白片段可达到4-20μg/cm2的包被密度。

（1）包被前，用无菌PBS将该溶液稀释至20-100μg/ml。【请提前计算重组人纤粘连蛋白试剂的用量，如：2.25ml浓度为20μg/ml的重组人纤粘连蛋白溶液放入直径为35mm的培养皿（9cm2）中时，用于包被的密度为5μg/cm2】

注意：为避免重组人纤粘连蛋白片段丢失，请勿将PBS稀释的重组人纤粘连蛋白溶液过滤除菌。

（2）将适当体积（24孔板中每孔0.5 ml，或6孔板每孔2 ml。）的无菌重组人纤粘连蛋白溶液分配到每个板中，让板在室温下静置2小时或在4℃过夜。

注意:在此步骤中应使用未经处理的细胞培养级组织培养板或培养皿。

（3）移除重组人纤粘连蛋白溶液，然后用适量含无菌2%牛血清白蛋白(BSA，Fraction V)的PBS溶液进行封闭（24孔板中每孔0.5 ml，或6孔板每孔2 ml），让板在室温下静置30分钟。

（4）移除BSA溶液，用适当体积的HBSS/Hepes或PBS清洗一次。除去洗涤液后，即可使用。重组人纤粘连蛋白片段包被板可用封板膜密封，并在4℃下储存—周。

2.基因转导

使用重组人纤粘连蛋白试剂进行基因转导的方法有两种:重组人纤粘连蛋白结合病毒感染法(A方法)和上清液感染法(B方法)。在A方法中，逆转录病毒颗粒首先结合到涂有重组人纤粘连蛋白试剂的板上，去除病毒上清液后加入靶细胞。在B方法中，将病毒溶液和靶细胞混合，然后添加到重组人纤粘连蛋白片段包被板中。

如果病毒溶液未经纯化直接用于病毒感染，可能会因为污染导致基因转导效率降低。在这种情况下，推荐使用A方法，通过将病毒与重组人纤粘连蛋白试剂结合并去除上清液来去除抑制物。

A.重组人纤粘连蛋白结合病毒感染方法

A-1.病毒结合板制备（无需离心）

1.将125- 250μl/cm2的逆转录病毒上清液添加到涂有重组人纤粘连蛋白的培养板或培养皿中。

2.在5% CO2培养箱中 32℃或37℃孵育4至6小时，使病毒颗粒与重组人纤粘连蛋白试剂充分结合。

3.弃上清液，但不要让培板干燥。用适当体积的 PBS或含有0.1-2%白蛋白(BSA或HSA)的 PBS清洗，清洗后按A-3进行感染。

A-2.离心法制备病毒结合板

如果病毒滴度足够高，则病毒与重组人纤粘连蛋白试剂的结合无需离心即可完成，如A-1中所述。

但如果滴度较低，或者您需要更高的基因转导效率，则最好通过离心结合病毒。使用这种方法，结合逆转录病毒所需的时间显着减少(离心法2小时，非离心法4-6小时)。一块未经处理的细胞培养板，在32℃下可以承受1,000-2,000g离心2小时。此外，请注意有可能形成气溶胶。

1.将125-500μl/cm2的逆转录病毒原液或稀释溶液添加到重组人纤粘连蛋白片段包被板中。

2.将板置于预热至32℃的离心机中，并在32℃ 1,000-2,000g 下离心2小时，以使病毒颗粒与重组人纤粘连蛋白试剂充分结合。

3.弃上清液，但不要让板干燥。用适当体积的PBS或含有0.1-2%白蛋白(BSA或HSA)的PBS清洗，然后按照A-3进行病毒感染。

A-3.病毒感染

在逆转录病毒颗粒与重组人纤粘连蛋白片段包被板结合时准备靶细胞。靶细胞处于对数生长期并表达整合素受体VLA-4和/或VLA-5至关重要。当使用造血干细胞时，可能需要用细胞因子进行预刺激，细胞因子类型应根据您的具体研究方案确定。

1.收集目标细胞并计算活细胞的数量，然后以细胞浓度0.2-1x10⁵/ml将细胞悬浮在生长培养基中。

2.从A-1或A-2制备的病毒结合板中去除洗涤液。不要让板干燥。立即加入密度为0.5-2.5x 10⁴/cm2的靶细胞。虽然最佳细胞密度取决于细胞大小和生长速率，但初始细胞密度还是应使细胞转导后2-3天分析时能够积极生长或接近汇合。当感染更多细胞时，可能会增加细胞密度，但细胞在基因转导后需要传代培养。

3.在37℃、5% CO2的培养箱中孵育2-3天。

4.收集非贴壁和贴壁细胞:

（1）将上清液转移到离心管中。

（2）用PBS洗涤培养板，收集剩余的非贴壁细胞。

（3）分离贴壁细胞。

（4）将步骤(1)-(3）中获得的细胞混合在同一管中，离心回收细胞。

（5）用HBSS/Hepes溶液洗涤细胞两次，并通过离心收集。如果还需进行进一步分析，可将细胞在HBSS/Hepes溶液重悬（适用于细胞下游应用的任何缓冲液或培养基也可用于重悬）。

B.上清液感染方法

使用病毒原液时，推荐A方法，但如果稀释4倍及以上，A、B方法都可以用，因为可获得等效的基因转导效率。此外，B方法感染病毒所需的时间比A方法短很多。

1.将靶细胞悬浮在已用生长培养基稀释的病毒溶液中以制备细胞悬液。

2.将细胞悬液添加到重组人纤粘连蛋白片段包被板中，细胞密度为0.5-25×10⁴/cm2。虽然最佳细胞密度取决于细胞大小和生长速率，但在转导后2-3天分析基因表达时，初始细胞密度应允许细胞积极生长或接近汇合。当感染更多细胞时，可能会增加细胞密度，但细胞在基因转导后需要传代培养。

3.在37℃、5% CO2的培养箱中培养2-3天。

4.收集非贴壁和贴壁细胞:

（1）将上清液转移到离心管中。

（2）用PBS洗涤培养板，收集剩余的非贴壁细胞。

（3）分离贴壁细胞。

（4）将步骤(1)-(3）中获得的细胞混合在同一管中，离心回收细胞。

（5）用HBSS/Hepes溶液洗涤细胞两次，并通过离心收集。如果还需进行进一步分析，可将细胞在HBSS/Hepes溶液重悬（适用于细胞下游应用的任何缓冲液或培养基也可用于重悬）。