Cephalosporiumspp.头孢霉属染料法荧光定量P

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类，探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA、RNA样品进行定量（包括绝对定量和相对定量）和定性分析。

Cephalosporiumspp.头孢霉属染料法荧光定量PCR试剂盒产品及特点    
本产品是根据探针法荧光定量 PCR 原理开发的检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物等组分经过优化，灵敏度高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据中间普雷沃菌 DNA 序列高度保守区设计，不会跟其他生物样本的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研

Cephalosporiumspp.头孢霉属染料法荧光定量PCR试剂盒使用方法：
一、DNA 提取(样本制备区) 
用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
二、稀释标准曲线样品(样本制备区)
 （由于阳性对照浓度高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入45 μL DEPC-H2O，（最好用带芯枪头，下同）。
3.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
若无需制作标准曲线，将阳性对照稀释到1×10E5拷贝/μL即可。
三、试剂配制(试剂准备区)
若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管(N个待检样品+1个阴性对照+6个阳性对照)，向各PCR管中分别加入下列成分(见详细说明，可向我司索取)
转移至样本准备区。
四、添加模板(模板添加区)
向qPCR管中分别加入2ul模板，加样顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板、婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。
五、扩增反应(扩增及产物分析区)
将PCR管放置在PCR扩增仪器样品槽相应位置，进行扩增，扩增程序如下：(见详细说明，可向我司索取)

Cephalosporiumspp.头孢霉属染料法荧光定量PCR试剂盒注意事项：
1所有操作严格按照说明书进行；
2试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3反应液应避光保存；
4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Cephalosporiumspp.头孢霉属染料法荧光定量PCR试剂盒结果分析
1. 如果制作标准曲线，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的log 值，推算出其浓度。
2. 如果未制作标准曲线，按照如下标准判定结果：
阳性对照结果：Ct 值<30，有明显指数增长，呈典型的S 型曲线。
阴性对照结果：Ct 值>38 或无Ct 值，无明显指数增长期和平台期。
样本检测结果：Ct 值<35，有明显指数增长，表明样本中检测出婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct 值>38 或无Ct 值，表明样本中未检测出婴儿利什曼虫，结果为阴性；Ct值在35-38 范围，应对样本进行复检，如重复实验结果Ct 值仍在35-38 范围，有明显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。

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