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4.测试结束提供实验报告后,样本可以保留1个月,若需保留样本或者回收样本请提前告知。
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文献和实验。 5. 电泳分析:EMSA的典型分析结果可以参见下面的图1。 图1. 一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图 1,阴性对照反应(标记探针);2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针);4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针);5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异
): 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构,可抑制蛋白对标记探针的非特异结合,避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合,比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时,不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC),如加入,则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。 未标记的竞争性寡核: 做为竞争的探真来说,其实
情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。 五、常见问题 1、为什么看不到迁移带? 1)蛋白样本提取质量不高,蛋白降解或者提取量不足。 2)样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3)探针与蛋白无特异性的相互作用。 4)转膜效率低,蛋白或者探针未转移到膜上。 5)曝光或者成像时间过短。 在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因: 6)抗体没有
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