Cy3标记驴抗兔IgG

双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤

FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化―抗兔IgG。进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3

间接放射免疫法检测待测样品mTNF

抗TNF的抗血清（4）二抗：125I标记的驴抗兔IgG（5）未免疫兔血清（6）制备好的巨噬细胞悬液（细胞浓度为1×106ml）（7）96孔PVC板（聚本乙稀板）（8）γ-计数仪，温浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头）三、操作步骤（1）将准备好的巨噬细胞悬液加入PVC板各孔中，0.1ml/孔，再用1%多聚甲醛固定于PVC板中，然后用PBS洗去多余的多聚甲醛；（2）设立不同倍比稀释度的TNF标准品；（3）加入3%BSA-PBS，每孔0.1ml， 37℃孵育1h，以封闭抗体非特异性结合位点；（3）加入3%BSA

免疫荧光单标检测

化物酶的活性。PBS洗3遍。 五．封闭  3-5%BSA或者1-2%FBS封闭30min 六．除去封闭液液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体， 4℃过夜。 抗体稀释液：1%FBS溶液（可以加0.01%叠氮钠） 七．洗一抗:PBS洗3遍，每次5min。 八．孵二抗2h(室温)FITC标记山羊抗兔二抗;Cy3标记驴抗山羊二抗 九．洗二抗   PBS洗3遍，每次5min 十．擦干标本边缘水分，加DAPI（1ug/ml）5min; 十一.PBS洗3遍，每遍3min，加mouting（sigma M1289）,盖盖玻片