WB蛋白Marker II (可显影)

WB 为何又翻车？

最近师妹开始做 WB 实验了，但是一天又一天重复做，却次次结果不理想。除了没有拿到组会可以汇报的条带外，师妹集齐了所有奇奇怪怪的条带：微笑带，皱眉带，拖尾带，甚至没有条带…… 师妹也因此对我发出了灵魂拷问：「为什么 WB 实验这么容易翻车？」 虽然 WB 是一类基础实验，但是基础并不代表简单。翻车的主要原因在于 WB 的步骤实在繁琐：从配置蛋白胶开始，到蛋白电泳、蛋白转膜、抗体孵育，一整套流程下来花费 1～2 天的时间才能进行最后的显影。这些环节中但凡有一个出错，就会导致实验

WB实战指南（七）：显影-淬灭的祸因

显影--淬灭的祸因当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：交联在二抗上的HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成分，催化剂和中间递质（白色瓶子

WB的疑问

buffer前的蛋白质浓度是否相差很大，从而导致蛋白质与SDS结合的比率严重失调，以及之后的上样容积相差过大而导致相邻上样孔之间的推移。这就涉及到下一步确定方法： 3、即，转膜后用丽春红染时，总的蛋白条带是否整齐，有无上下不均、偏移等现象。一般40kDa多的地方会有染色较明显的条带(我不确定此现象是否普遍，是否是内参Actin），与蛋白Marker对比下，感觉如何。 再来试着与楼上的兄弟讨论一下吧。 1、目的蛋白不显影，是否是所检测的组织或细胞