小鼠基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)ELISA Ki

 

小鼠基质金属蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）ELISA Kit

货号：TD-EM10671

保质期：请见试剂盒外包装标签。

技术支持：为了更好地给您提供服务，联系时请告知产品外包装标签上批号。

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用途

该试剂盒用于体外定量检测血清、血浆或其他相关生物液体中Mouse TIMP-1浓度。

 

灵敏度、检测范围、特异性和重复性

●灵敏度：46.87pg/mL。

●检测范围：78.12-5000pg/mL。

●特异性：可检测样本中的Mouse TIMP-1，且与其它类似物无明显交叉反应。

●重复性：板内，板间变异系数均<10%。

 

检测原理

本试产品采用双抗体夹心ELISA法。用抗Mouse TIMP-1抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的Mouse TIMP-1会与包被抗体结合。后依次加入生物素化的抗Mouse TIMP-1抗体和HRP酶标记的亲和素，抗Mouse TIMP-1抗体与结合在包被抗体上的Mouse TIMP-1结合，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在HRP酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测OD值，Mouse TIMP-1浓度与OD450 OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中Mouse TIMP-1的浓度。

 

试剂盒组成及保存

未开封试剂盒应保存在2-8℃。收到货后请参照下表中保存条件进行存储。

 

组分名称	规格	保存条件及注意事项
酶标板 Micro Plate	96T: 8孔×12条	未拆封： -20℃, 12个月	未用完： 应放回铝箔袋中密封好，-20℃保存
	48T: 8孔×6条
标准品 Reference Standard	96T: 2支	未溶解： -20℃, 12个月	每次实验请使用新溶解的标准品，溶解后未用完标准品弃用
	48T: 1支
浓缩生物素化抗体(100×) Biotinylated Detection Ab Concentrate (100×)	96T:120μL×1支	-20℃, 12个月	未用完：浓缩液请密封好后放回-20℃，工作液请丢弃
	48T: 60μL×1支
浓缩HRP酶结合物(100×) HRP Conjugate Concentrate (100×)	96T:120μL×1支	-20℃(避光), 12个月	未用完：浓缩液请密封好后放回-20℃，工作液请丢弃
	48T: 60μL×1支
标准品&样品稀释液 Reference Standard & Sample Diluent	20mL×1瓶	2-8℃, 12个月
生物素化抗体稀释液 Biotinylated Detection Ab Diluent	14mL×1瓶
HRP酶稀释液 HRP Conjugate Diluent	14mL×1瓶
浓缩洗涤液(25×) Wash Buffer Concentrate (25×)	30mL×1瓶
底物溶液TMB Substrate Reagent(TMB)	10mL×1瓶	2-8℃(避光), 12个月
终止液 Stop Solution	7mL×1瓶	2-8℃/常温
封板覆膜	5张
产品说明书	1 份
质检报告	1 份

说明：
保存时请确保所有试剂瓶的瓶盖都旋紧，以防止试剂蒸发和避免微生物污染。
试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。

 

检测前注意事项

1. 试验中请穿戴好防护装备，接触血液样本或其它生物样本时，请参照国家生物实验室安全防护条例做好生物安全防护工作。
2. 不同批号的试剂盒组份不能混用(Stop Solution除外)。
3. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，请勿混用。
4. 刚开封的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成影响。暂时不用的板条应放入备用铝箔袋，按照组分表中保存条件进行存放。
5. 已稀释过的标准品及生物素化抗体工作液、酶结合物工作液请勿重复使用。
6. 未用完的浓缩生物素化抗体(100×)、浓缩HRP酶结合物(100×)及其它原液请按照组分表中的保存条件进行存放。
7. 酶标仪需要安装能检测450±10nm波长的滤光片，检测范围在0-3.5之间。

 

检测前自备物品

1. 酶标仪（450nm波长滤光片）、37℃恒温孵育箱。
2. 1.5mL EP管、吸水纸。
3. 移液器及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL。
4. 双蒸水或去离子水。

 

检测前准备工作

1. 平衡至室温：将试剂盒提前20分钟取出冰箱，使其平衡至室温。
2. 酶标仪预热：检测时，请至少提前15分钟打开酶标仪，使酶标仪光源稳定。
3. 洗涤液制备：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)。
   提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。
4. 标准品工作液制备：
   4.1 将标准品于10000×g离心1分钟。
   4.2 向冻干标准品中加入1.0 mL标准品及样品稀释液。旋紧管盖后，静置10分钟。期间上下颠倒管子数次，以助于标准品的溶解。
   4.3 待标准品完全溶解后，用移液枪轻轻混匀，制备成5000pg/mL的标准品工作液。
   4.4 根据实验需求，对标准品进行倍比稀释，建议配制的浓度梯度为：5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.12、0 pg/mL。
   4.5 倍比稀释方法：
   准备7支EP管，每管加入500μL的标准品&样品稀释液。
   从5000pg/mL的标准品工作液中取500μL，加入到第一支EP管中，移液枪混匀，制备成2500 pg/mL的标准品工作液。
   接着，从2500 pg/mL的EP管中取500μL，加入到第二支EP管中，移液枪混匀，制备成1250 pg/mL的标准品工作液，以此类推，得到倍比稀释的标准品工作液。
   注意：最后一管作为空白对照。加入标准品&样品稀释液即可。
5. 生物素化抗体工作液制备：
   计算用量：以100μL/孔的试剂需求量进行计算，并额外增加100-200μL，以备不时之需。
   抗体稀释：在实验前15分钟，使用生物素化抗体稀释液将浓缩生物素化抗体(100×)稀释并混匀至1×工作浓度。稀释后的抗体应于当日使用，以保证实验效果。
6. 酶结合物工作液：
   计算用量：以100μL/孔的试剂需求量进行计算，并额外增加100-200μL，以备不时之需。
   抗体稀释：在实验前15分钟，使用生物素化抗体稀释液将浓缩HRP酶结合物(100×)稀释并混匀至1×工作浓度。稀释后的抗体应于当日使用，以保证实验效果。

实验操作过程

1. 加标准品&样品：
   将不同浓度标准品工作液按从上到下顺序加入到前两列酶标板孔中，每个浓度两孔，每孔100μL；待测样品加入其余孔，每孔100μL。高浓度样品需先稀释。
   操作时，从酶标板底部加样，避免接触孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡，加样操作控制在10分钟内完成。
2. 覆板&孵育：
   撕开封板覆膜，将板孔覆盖紧密。37℃孵育90min。
3. 加生物素化抗体：
   撕开覆膜，清除并甩干板孔内液体，无需洗涤。
   按100μL/孔向所有孔加入稀释好的生物素化抗体工作液。轻轻晃动混匀，覆盖酶标板覆膜。37℃孵育60min。
4. 洗板1：
   清除并甩干板孔内液体，按350μL/孔，加入稀释好的洗涤液，浸泡1-2min，清除并甩干板孔内液体，在厚吸水纸上拍干板孔，完成一次洗涤。
   总计洗板3次。甩干板孔液体供下一步使用。
5. 加酶结合物工作液：
   按100μL/孔向所有孔加入稀释好的酶结合物工作液。轻轻晃动混匀，覆盖酶标板覆膜。37℃孵育30min。
6. 洗板2：
   洗板5次，步骤同第4步洗板1操作。
7. 加底物溶液(TMB)：
   按90μL/孔向所有孔加入底物溶液(TMB)。覆盖酶标板覆膜。37℃，避光孵育15min左右。
   提示：根据显色情况调整孵育时间，但不要超过30分钟。一旦标准孔显示出清晰的梯度，即可停止孵育。
8. 终止反应：
   按50μL/孔，向所有孔加入终止液，终止反应。
   提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
9. 测量OD值：
   立即用酶标仪在450nm波长测量酶标板各孔的OD值(光密度)。

 

检测结果计算

1. 计算平均OD值并绘制标准曲线：
   计算每组标准品复孔的平均OD值。
   从每个标准品的平均OD值中减去空白孔的OD值，得到标准品矫正OD值。
   以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用Logistic函数绘制标准曲线。绘制时排除空白组的OD值。
2. 样本浓度计算：
   将样本测得的OD值带入曲线中即可求出样本OD值对应浓度。样本若有稀释倍数，在所得浓度上乘以稀释倍数即可得到样本原液浓度。
3. 高OD值样品处理：
   如果样品的OD值超过了标准曲线的上限，应适当稀释样品后重新测量。

 

问题分析

如果实验结果不理想，请立即拍摄显色结果的照片，保存所有实验数据，并保留使用过的板条以及未用尽的试剂。之后，请联系我们的技术支持团队，以便我们协助您解决问题。同时，您也可以查阅以下资料以获取更多帮助。

 

问题描述	可能原因	相应对策
标准曲线梯度差	吸液或加液不准	检查并校准移液枪及吸头
	标准品稀释不正确	溶解标准品时轻轻旋转瓶身，确保粉末完全溶解
	洗涤不完全	确保洗涤时间和次数，以及每孔的加液量
显色很弱或无色	孵育时间太短	保证充足的孵育时间
	实验温度不正确	使用推荐的实验温度
	试剂体积不够或漏加	检查吸液及加液过程，确保按顺序足量添加
	稀释不正确	重新检查稀释步骤
	酶标记物失活或底物失效	混合酶结合物和底物，通过显色结果判断
读数数值低	酶标仪设置不正确	检查酶标仪的波长及滤光片设置，确保是450nm
		提前打开酶标仪预热15min及以上
变异系数大	加液不正确	检查加液情况，确保准确性
背景值高	检测抗体的工作浓度过高	使用推荐的稀释倍数
	酶标板洗涤不完全	保证每步清洗完全；如果用自动洗板机，请检查所有的出口是否有堵塞；是否使用试剂盒配备的洗涤液
	洗液有污染	使用新鲜的洗液
灵敏度低	ELISA试剂盒保存不当	按说明书要求保存试剂
	读数前未终止	OD读数前向所有孔加入终止液

 

 

样品收集方法

1. 血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。
2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na₂，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，如1g的组织样品加入9mL的PBS，具体比例可根据实验需要适当调整。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞提取液：
   贴壁细胞：用预冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞。
   悬浮细胞：可直接离心收集。
   收集的细胞用预冷的PBS洗涤3次。每10⁶个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。
5. 细胞培养上清或其他生物体液：收集液体后1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

 

样品注意事项

1. 样品收集后保存说明：
   1周内检测：2-8℃，保存。
   1个月内检测：请分装成单次使用量，并保存于-20℃。
   3个月内检测：请分装成单次使用量，并保存于-80℃。
2. 请留意，您样本的浓度范围可能超过试剂盒的检测范围。如遇此情况，建议先进行预实验，以确定合适的稀释比例，确保结果的准确性。(建议查阅文献后先做预实验，以确定稀释倍数)
3. 若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。
4. 若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由此引入的某些化学物质可能会导致测值结果出现偏差。
5. 请知悉，部分重组蛋白可能与试剂盒中的捕获或检测抗体不匹配，导致无法检测。

 

产品使用声明：

1. 质量技术风险提示：受限于当前科学技术水平和条件限制，尚无法对所有原料进行全面的鉴定分析。本产品可能存在一定的质量技术风险。
2. 实验结果影响因素：实验结果受试剂有效性、操作者技能和实验环境等多种因素影响。为确保结果准确性，请准备充足的待测样品。
3. 试剂使用指南：为获得最佳实验效果，建议仅使用本试剂盒内提供的试剂，并严格按照说明书操作。避免与其他制造商的产品混用。
4. 操作注意事项：不正确的试剂配制或酶标仪参数设置可能导致实验结果异常。请在实验前仔细阅读说明书，并正确调整仪器参数。
5. 结果重现性：即使是同一操作者，在两次独立实验中也可能得到不同结果。为确保结果的重现性，请严格控制实验过程中的每一步操作。
6. 质量保证与差异说明：尽管试剂盒在发货前经过严格质检，但由于运输条件、实验设备差异等因素，用户检测结果可能与出厂数据存在差异。不同批次试剂盒间的差异也可能源于上述原因。

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