PAGE浓缩胶绿色染料（200×）

SDS-PAGE蛋白质电泳常见问题分析

迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响? A：在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩

操作篇：western blot 之 SDS－PAGE 电泳

20-50μl 蛋白（注意：根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。 取出上样样品至 200μl 的 EP 管中，加入 5×SDS 上样缓冲液至终浓度为 1×。（上样总体积一般不超过 15μl，加样孔的最大限度可加 20μ 样品，其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上样量可以达到 40μl，胶做得很好的话 50μ 也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮 5-10 min 使蛋白变性。 本人心得：可以使用 PCR 仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮

蛋白分离的不连续缓冲系统的比较

在电泳开始的时候，SDS-PAGE 利用不连续系统，在浓缩胶中浓缩或"堆积"样品，使其成为一条非常锐利的区带。在不连续缓冲系统中，最初胶中的阴离子不同于（或不连续）电泳缓冲液中开始时的阴离子。NuPAGE系统（Bis-Tris和Tris-Acetate）和Laemmli(Tris-Glycine)系统二者均为不连续系统的例证，以相同的方式起作用。但是，作为NuPAGE系统中不同离子的结果，这个系统在一个较低的pH值下工作。Tris-Glycine系统（图1）的情况，主要包括三种离子： a)氯