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文献和实验提取样品的总RNA后,一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构,因此常用甲醛变性胶来进行RNA电泳,得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。一、试剂:DEPC(Sigma公司产品),MOPs(Bocherigmer公司产品),甲酰胺(Formamide,Sigma公司产品),溴酚蓝(Bromphenol Blue,Sigma公司产品)。EDTA-Na2,氢氧化钠,醋酸钠,甲醛,甘油,分析纯,国产。二、试剂配制:1、DEPC 水的处理:用量筒量取去离子水2L
好,有人说这步要放在冰上,但是我的经验室温就可以,室温更有利于 Trizol 完全发挥作用,而且毕竟 Trizol 含有 RNA 酶抑制剂,不用担心 RNA 降解) c. 加入氯仿室温静置 15 分钟(国产试剂真是坑爹啊,说明书把这步时间缩短到 3 分钟,出来效果奇差) d. 离心 15 分钟,这是管见的一步,离心后分成三层,RNA 在上清里,所以离心管从离心机拿出来的时候要轻巧,以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定一定轻,切忌吸取太多,少量即可,洗到 400-500ul
的histag一抗100ul/孔,ELISA板于室温振荡0.5-1小时,TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗,个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好,Invitrogen和Labvision的一般般,一般1:1000-5000稀释,不同公司的抗体效价不同。 5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔,ELISA板于室温振荡0.5-1小时,TPBS洗3次。二抗很多公司有,国产的华美都可以,1:500-1000。如果是HRP标记的histag抗体,不加二抗直接显色。
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