31016 酵母高纯质粒小提试剂盒（离心柱型）50次

HiPure Yeast Plasmid Mini Kit

酵母高纯度质粒小量快速提试剂盒

目录号：31016

产品内容：

产品组成	保存	31016-50	31016-100	31016-200
溶液YP1	室温	15 ml	25 ml	50 ml
溶液YP2	室温	15 ml	25 ml	50 ml
溶液YP3	室温	20 ml	35 ml	70 ml
去蛋白液 PD	室温	25 ml	50 ml	100 ml
漂洗液 WB	室温	13 ml	25 ml	50 ml
洗脱缓冲液 EB	室温	10 ml	15 ml	20 ml
RNase A (10 mg/ml)	-20℃	150 ul	250 ul	500 ul
Lyticase	-20℃	2500U	5ku	10ku
吸附柱和收集管	室温	50 套	100 套	200 套

保存条件：

在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存 12 个月。加入 RNase A 后的溶液 P1 应置于 2 ~ 8℃保存，可稳定保存 6 个月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新补加即可。

产品简介：

本试剂盒用于高纯度酵母质粒 DNA 的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH 处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH 条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。

注意事项：

1.   通常酵母的拷贝数都很低，高拷贝最大得率一般为每 5 ml 培养物提取 1μg 左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl 用做 PCR 模板;5-10μl 用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。

2.   用户需要自备 Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在 600 ml 去离子水里面溶解 182.2 克山梨醇，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节 PH 值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β-巯基乙醇(商品化的 β-巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。

3.   使用前请先检查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 
      4.   溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；重要提示：

一、第一次使用前请先漂洗液 WB 中加入无水乙醇（详见瓶身标签），混匀，并做好标记。
       二、首次使用时请先将 RNase A 全部加到溶液 YP1 中，混匀，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。
      三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

操作步骤：

1.取 1.5-5 毫升酵母培养物(不超过 5x 107 cells)，9,000rpm 离心 30 秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

（注意： 如果用 50ml 离心管收集菌体，可以离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够多的菌体）

2.    加入 600μl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；可按照 20-50U/1x107 cells 的比例加入 Lyticase(一般 5 ml 培养物可能需要加到 200U)，充分颠倒混匀，37℃温育至少 30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

（注意：如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。）

3.   13,000rpm 离心 1 min，尽可能吸弃上清，加入 250 ul 溶液YP1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。

（注意：如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

4.  加入 250 ul 溶液YP2，温和地上下翻转 6-8 次，使菌体充分裂解，室温放置 4 min。

（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组 DNA 片段的污染，所用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏，如未完全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2 的用量，在后续的操作中溶液 YP3 的用量也要相应增加）

5.加入 350 ul 溶液 YP3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，

然后室温 13,000 rpm 离心 10 min。

（注意：加入溶液 YP3 后应立即混合，避免产生 SDS 的局部沉淀）

6.   将上清液转移到吸附柱中，室温 12,000 rpm 离心 1 min，质粒被吸附在膜上，弃滤液。

7.    可选步骤：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室温 12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。

（注意：去蛋白液 PE 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α或 TOP10，此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤）

8.加入 600 ul 漂洗液 WB，室温 12,000 rpm 离心 30 sec，弃滤液。

（注意：漂洗液 WB 为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

9.    重复步骤 8 一次。

10.   室温 12,000 rpm 离心 2 min，甩干残留液体。

（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）

11. 将吸附柱置于一个新的 1.5 ml 离心管（自备）中，加入 50 ~ 100 ul 的洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 1 min，离心管底溶液即质粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1 min 收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之间。）