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- 2025年07月14日
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99
- 英文名：
FlashPure Plus Tissue/Cell/Insect Total RNA Mini Kit
- 供应商：
北京诺博莱德科技有限公司
FlashPure Plus Tissue/Cell/Insect Total RNA Mini Kit 动物组织/细胞/昆虫总 RNA 提取试剂盒（带 gDNA 过滤器）
目录号：91218
产品内容
|
产品成份 |
91218-50（50 次） |
|
裂解液 ARL Plus |
30 ml |
|
去蛋白液 RW1 |
40 ml |
|
漂洗液 RW |
10 ml（需加入指定量无水乙醇） |
|
70%乙醇 |
9 ml（需加入指定量无水乙醇） |
|
RNase-Free H2O |
10 ml |
|
gDNA 过滤器和收集管 |
50 套 |
|
RNA 吸附柱和收集管 |
50 套 |
|
RNase-Free 1.5 ml 离心管 |
50 支 |
|
RNase-Free 2.0 ml 液氮研磨管 |
50 支 |
自备试剂
无水乙醇
保存条件
室温（15~25℃），有效期 12 个月。
产品简介
适用于快速提取各种动物组织、细胞、昆虫的总 RNA，gDNA 过滤器高效滤除 gDNA，RNA 可直接用于 RT，RT-PCR，RT-qPCR，普通转录组测序、RACE 等。
产品特点
1. 无毒：免氯仿、免β-巯基乙醇！
2. 高质：28s/18s=2:1，OD260/280=2.0～2.2！
3. 高效：提取全过程仅需 10 min！
重要提示：
① 第一次使用前，请先在漂洗液RW中加入无水乙醇，详见标签。
② 所有离心步骤均需要在室温（15~37℃）下进行。
③ 高丰度样本（肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、心脏）的投入量减半。
操作步骤：
1. 动物组织、昆虫：
a．电动匀浆：取新鲜组织 10~20 mg 加入 350μl的裂解液ARL Plus，电动匀浆，直到无明显组织块即可。
b．液氮研磨：在液氮中研磨组织成细粉，取10~20 mg组织细粉加入350μl裂解液ARL Plus，剧烈涡旋振荡20sec，充分裂解。
注意：裂解 20~30 mg 组织，需要加入 600 μl 裂解液 ARL Plus。
c． 将匀浆后裂解物13，000 rpm 离心3min。
d．下接步骤 3。
2. 细胞
a．悬浮细胞：收集<107悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管；
贴壁细胞（培养皿培养）：完全吸弃培养基后，直接在培养皿中加入裂解液ARL Plus进行消化、裂解；
贴壁细胞（细胞瓶培养）：应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b．13,000 rpm 离心 10 sec，完全吸弃上清，留下细胞团。
c．轻弹管底使细胞松散，然后加入350μl（<5x106 细胞）或600μl（5x106-1x107细胞）裂解液 ARL Plus，涡旋振荡，充分混匀。
d．下接步骤 3。
贴壁细胞培养数量表：（细胞数量＞1x107，请酌情增加裂解液的用量）
|
培养器皿 |
面积（cm2） |
培养液量 （ml） |
细胞数量 |
|
96 孔培养板 |
0.32 |
0.1 |
105 |
|
24 孔培养板 |
2 |
1.0 |
5×105 |
|
12 孔培养板 6 孔培养板 3.5cm 培养皿 |
4.5 9.6 8 |
2.0 2.5 3.0 |
106 2.5×106 2×106 |
|
6cm 培养皿 |
21 |
5.0 |
5.2×106 |
|
9cm 培养皿 |
49 |
10.0 |
1.22×107 |
|
25cm 培养瓶 75cm 培养瓶 100cm 玻璃培养瓶 |
25 75 33 |
5.0 15～30 10 |
5×106 2×107 7x 106 |
3. 将裂解物上清或者裂解物全部加到gDNA 过滤器上（过滤器放在收集管内），立刻 13,000 rpm 离心1 min，保留滤液（RNA 在滤液中）。
4. 向滤液中加入等体积（350μl / 600μl）的70%乙醇，吹打混匀。
5. 每次吸取≤750μl滤液混合物转入一个RNA吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心1min，倒弃滤液。此时，RNA被吸附在膜上，重复此过程，直到溶液全部上柱。
6. 加入700μl去蛋白液 RW1,室温放置 1min,13,000 rpm 离心30sec，倒弃滤液。
7. 加入500μl漂洗液 RW，13,000 rpm 离心30sec，倒弃滤液。
8. 重复步骤7。
9. 把RNA吸附柱放回收集管中，13,000rpm 离心2min，彻底除去膜上的乙醇。
10. 取出RNA吸附柱，放入一个RNase-free 1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加30-50μl RNase-Free H2O，室温放置1 min，13,000rpm离心 1 min。
11. 得到的 RNA，可直接用于下游实验，或于-70℃保存，以免降解。
附录：
一、免液氮直接研磨（自动研磨仪）——适用于新鲜样本
a. 在 2.0 ml 液氮研磨管中加入4mm 两粒，加600μl裂解液ARL plus，放进20 mg 左右的样本，设置65个频率，震荡2min。
b. 将裂解物 13,000 rpm 离心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。
二、液氮研磨（自动研磨仪）:
a. 把研磨模块丢到液氮中预冷，直到没有气泡冒出视为预冷完毕。
b. 在2.0ml液氮研磨管中放入3mm 钢珠3粒，放进20-30mg 样本，投入液氮中预冷。
c. 把预冷好的离心管插入研磨模块中，放进研磨仪，设置 55 个频率， 震荡 30~60 sec。（以北京赫得研磨仪——京 N9548 为例）
d. 研磨完成后，马上加 600 μl 裂解液 ARL Plus，剧烈涡旋振荡,充分
混匀。
e. 将裂解物 13,000 rpm 离心 3 min，沉淀不能裂解的碎片。
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文献和实验酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。 细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯
DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒
聚合酶在72℃下加热2h。 4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。 5.加入2倍体积 95％乙醇,在-20℃下沉淀1hr。 6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。 五、PCR产物与载体粘末端连接 1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。 2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。 3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。 六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接 1. 在50ml的PCR
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